विच्छेदन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इस विधि का उपयोग कई सी.एलिगेंस प्रयोगशालाओं द्वारा किया जाता है। इसे किसी भी प्रोटीन का पता लगाने के लिए अपनाया जा सकता है जिसके लिए एंटीबॉडी या टैग किया गया संलयन प्रोटीन उपलब्ध है। यद्यपि इस विच्छेदन को सही करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है, यह प्रोटोकॉल समस्या निवारण के लिए लचीला और सीधा है।
हमारे लिए, DAPI धुंधला हमेशा काम करता है और हम आमतौर पर एक ऐसी स्थिति पा सकते हैं जो प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए काम करती है। इस तकनीक के लिए सबसे बड़ी चुनौती विच्छेदन चरण है। आपको अच्छे जर्मलाइन एक्सट्रूज़न प्राप्त करने के लिए जल्दी लेकिन आत्मविश्वास से काम करना होगा।
अभ्यास महत्वपूर्ण है। शुरू करने के लिए, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के मंच पर एक होल्डिंग स्लाइड रखें और होल्डिंग स्लाइड के शीर्ष पर कवरस्लिप रखें। फिर, विच्छेदन समाधान के चार माइक्रोलीटर को कवरस्लिप के केंद्र में रखें और दृश्य को मुक्त करने के लिए होल्डिंग स्लाइड को मंच के एक तरफ ले जाएं।
विच्छेदन समाधान की बूंद में एनजीएम प्लेट से 10 से 20 हेर्मैप्रोडाइट्स चुनें। लगभग 10 प्रति स्लाइड चुनना सबसे अच्छा है लेकिन इतने अधिक नहीं कि उन्हें पांच मिनट के भीतर विच्छेदित नहीं किया जा सके। जानवरों को विच्छेदित करने के लिए, एक्स आकार बनाने के लिए सुइयों के बिंदुओं को पार करें और कवरस्लिप की सतह पर एक वयस्क को पिन करने के लिए एक्स के तल का उपयोग करें।
इसके बाद, एक्स आकार को ग्रसनी के ठीक पीछे रखें, एक युवा वयस्क के शरीर की लंबाई का लगभग पांचवां हिस्सा या सिर के स्पष्ट भाग के ठीक नीचे। फिर, जानवर को एक कैंची गति से काट दें, शरीर की गुहा से पूरी तरह से मुक्त करें, साथ ही आंत के एक या दोनों हिस्सों के साथ। फॉर्मलाडेहाइड के साथ नमूने को ठीक करने के लिए, कवरस्लिप पर फिक्स समाधान के चार माइक्रोलीटर, जानवरों के साथ बूंद के बहुत करीब, जबकि विच्छेदन बूंद में सीधे पिपेट करने और विच्छेदित शवों को विस्थापित करने से बचें।
एक उंगली का उपयोग करके कवरस्लिप को होल्डिंग स्लाइड पर पिन करें। दूसरी ओर, बूंदों को मिलाने के लिए कवरस्लिप को धीरे से कुछ बार फ्लिक करें। सकारात्मक रूप से चार्ज की गई स्लाइड को नीचे रखें, नमूना ड्रॉप को धीरे से छूकर स्लाइड के केंद्र में कवरस्लिप को उठाने के लिए इसका उपयोग करें, और ड्रॉप की सतह तनाव कवरस्लिप को उठाएगा।
बेंच पर स्लाइड सेट करें और कमरे के तापमान पर ठीक पांच मिनट के लिए ठीक करें। इस दौरान स्लाइड को पेंसिल से लेबल करें। चिमटी के साथ स्लाइड के लेबल किनारे को पकड़ते हुए तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके नमूने को फ्रीज करने के लिए, धीरे से इसे तरल नाइट्रोजन में कम करें।
स्लाइड को छोड़ दें, जैसे कि यह कवरस्लिप साइड के साथ बीकर के किनारे झुकता है, और स्लाइड 10 सेकंड के भीतर जमे हुए हैं। यदि फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ का उपयोग करते हैं, तो रेजर के साथ एल्यूमीनियम ब्लॉक की सतह से ठंढ को स्क्रैप करने के बाद, स्लाइड के लेबल वाले किनारे को मजबूती से पकड़ें और इसे साफ सतह पर सेट करें, ब्लॉक के साथ पूर्ण संपर्क सुनिश्चित करने के लिए नीचे की ओर कुछ दबाव डालें। फ्रीजिंग 10 सेकंड के भीतर होती है क्योंकि कवरस्लिप के नीचे नमूना बर्फ में बदल जाता है।
स्लाइड के लेबल वाले छोटे किनारे को मजबूती से पकड़कर जमे हुए स्लाइड को हटा दें, और बेंच के खिलाफ एक लंबे किनारे को ब्रेस करें। दूसरे हाथ से, दृढ़ता से एक रेजर को पकड़ें और कवरस्लिप को नमूने से दूर करने के लिए रेजर के किनारे को स्लाइड से नीचे स्लाइड करें। तुरंत स्लाइड को 95% इथेनॉल युक्त कोप्लिन जार में रखें, और स्लाइड को इथेनॉल में कम से कम पांच मिनट के लिए छोड़ दें।
फिर, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए पीबीएसटी में स्लाइड को तीन बार धोएं, जबकि प्रत्येक धोने के लिए ताजा पीबीएसटी का उपयोग करें। जर्मलाइन नाभिक के प्रतिदीप्ति इमेजिंग परिणामों ने प्रदर्शित किया कि डीएपीआई डीएनए को दृढ़ता से बांधता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला तब प्रभावी था जब आरएडी -51 को लक्षित करने वाला एंटीबॉडी, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के लिए एक मार्कर, मियोटिक नाभिक के भीतर असतत फॉसी के रूप में मौजूद था, जो डीएपीआई द्वारा चिह्नित गुणसूत्रों पर सह-स्थानीयकृत था।
केएलई -2 हेटरोजाइगोट उत्परिवर्ती में गुणसूत्र संरचना में मामूली दोष होते हैं, जैसा कि थोड़ा अव्यवस्थित डीएपीआई धुंधला होने और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक संख्या में वृद्धि से पता चलता है, जो आरएडी -51 फॉसी की उच्च संख्या में परिलक्षित होता है। विच्छेदन और फ्रीज क्रैक चरण दोनों मुश्किल हो सकते हैं इसलिए जल्दी और सुचारू रूप से काम करना महत्वपूर्ण है। हम पूरे प्रोटोकॉल का प्रयास करने से पहले इन चरणों का अभ्यास करने की सलाह देते हैं।
उदाहरण के लिए, आप 200 माइक्रोलीटर की तरह तरल की एक बड़ी मात्रा में विच्छेदन का अभ्यास कर सकते हैं, और धीरे-धीरे कवर स्लिप में चार माइक्रोलीटर की हमारी अनुशंसित मात्रा पर काम कर सकते हैं। इस तकनीक का उपयोग कॉन्फोकल या संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए किया जा सकता है, या इसका उपयोग डीएनए या आरएनए-फिश, सीटू संकरण में फ्लोरेसेंस के साथ संयोजन में किया जा सकता है, यह देखने के लिए कि विशिष्ट अनुक्रमों के संबंध में प्रोटीन कैसे स्थानीयकृत होते हैं।