해부 및 면역 형광을위한이 방법은 많은 C.elegans 실험실에서 사용됩니다. 항체 또는 태그된 융합 단백질을 사용할 수 있는 모든 단백질을 검출하는 데 채택할 수 있습니다. 이 해부를 올바르게 수행하려면 약간의 연습이 필요하지만 이 프로토콜은 유연하고 문제를 해결하기 쉽습니다.
우리에게 DAPI 염색은 항상 효과가 있으며 일반적으로 각 항체에 대해 작동하는 조건을 찾을 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 과제는 해부 단계입니다. 좋은 생식계열 압출을 얻으려면 빠르고 자신 있게 작업해야 합니다.
연습이 핵심입니다. 시작하려면 해부 현미경 스테이지에 홀딩 슬라이드를 놓고 홀딩 슬라이드 위에 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 4마이크로리터의 해부 용액을 커버슬립의 중앙으로 피펫팅하고 홀딩 슬라이드를 스테이지의 한쪽으로 이동하여 시야를 확보합니다.
NGM 플레이트에서 10-20 개의 자웅 동체를 해부 용액 방울로 선택하십시오. 슬라이드당 약 10개를 선택하는 것이 가장 좋지만 5분 이내에 해부할 수 없을 정도로 많지는 않습니다. 동물을 해부하려면 바늘 끝을 교차시켜 X 모양을 만들고 X의 바닥을 사용하여 성인을 커버 슬립 표면에 고정시킵니다.
다음으로, X 모양을 인두 바로 뒤, 젊은 성인의 신체 길이의 약 1/5 또는 머리의 깨끗한 부분 바로 아래에 놓습니다. 그런 다음 한 번의 가위 동작으로 동물의 목을 베고 내장의 한쪽 또는 양쪽 절반과 함께 체강에서 완전히 방출합니다. 포름 알데히드로 샘플을 고정하려면 4 마이크로 리터의 고정 용액을 커버 슬립에 피펫 (discette)으로 피펫 (discette)하여 동물과 함께 방울에 매우 가깝게 피펫팅하고 해부 된 시체를 직접 피펫팅하지 마십시오.
한 손가락을 사용하여 커버슬립을 고정 슬라이드에 고정합니다. 다른 손으로 커버 슬립을 부드럽게 몇 번 튕겨 방울을 섞습니다. 양전하를 띤 슬라이드를 앞면이 아래로 향하게 잡고 샘플 방울을 부드럽게 터치하여 슬라이드 중앙의 커버슬립을 들어 올리면 방울의 표면 장력이 커버슬립을 픽업합니다.
슬라이드를 벤치에 놓고 실온에서 정확히 5 분 동안 고정하십시오. 이 시간 동안 연필로 슬라이드에 레이블을 지정합니다. 핀셋으로 슬라이드의 레이블이 지정된 가장자리를 잡고 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결 균열하려면 액체 질소로 부드럽게 내립니다.
슬라이드가 커버슬립 쪽이 위로 향하도록 비커 측면에 기대도록 슬라이드를 놓으면 슬라이드가 10초 이내에 고정됩니다. 드라이 아이스를 사용하여 얼리는 경우 면도기로 알루미늄 블록 표면에서 서리를 긁어 낸 후 슬라이드의 레이블이 지정된 가장자리를 단단히 잡고 깨끗한 표면에 놓고 블록과 완전히 접촉하도록 아래쪽으로 약간의 압력을 가하십시오. 동결은 커버 슬립 아래의 샘플이 얼음으로 변하면서 10 초 이내에 발생합니다.
슬라이드의 레이블이 지정된 짧은 가장자리를 단단히 잡고 얼어붙은 슬라이드를 제거하고 긴 가장자리 하나를 벤치에 고정합니다. 다른 손으로 면도기를 단단히 잡고 면도기의 가장자리를 슬라이드 아래로 밀어 덮개 슬립을 샘플에서 튕겨냅니다. 즉시 슬라이드를 95 % 에탄올이 들어있는 코플린 병에 넣고 슬라이드를 에탄올에 5 분 이상 그대로 두십시오.
이어서, 슬라이드를 실온에서 각각 5분 동안 PBST로 3회 세척하고, 각각의 세척에 대해 신선한 PBST를 사용한다. 생식계열 핵의 형광 이미징 결과는 DAPI가 DNA에 강하게 결합한다는 것을 보여주었습니다. 면역형광 염색은 이중 가닥 절단에 대한 마커인 RAD-51을 표적으로 하는 항체가 DAPI로 표시된 염색체에 공동 국한된 유사 핵 내에 개별 초점으로 존재할 때 효과적이었습니다.
kle-2 이형 접합체 돌연변이체는 약간 무질서한 DAPI 염색 및 이중 가닥 절단 수의 증가로 나타난 바와 같이 염색체 구조에 경미한 결함이 있으며, 이는 더 높은 수의 RAD-51 초점에 반영됩니다. 해부 및 동결 균열 단계는 모두 까다로울 수 있으므로 빠르고 원활하게 작업하는 것이 중요합니다. 전체 프로토콜을 시도하기 전에 이러한 단계를 연습하는 것이 좋습니다.
예를 들어, 200 마이크로 리터와 같은 더 많은 양의 액체에서 해부하고 커버 슬립에서 권장 부피 인 4 마이크로 리터까지 점진적으로 작업 할 수 있습니다. 이 기술은 컨포칼 또는 구조화된 조명 현미경에서 고해상도 이미징에 사용하거나 DNA 또는 RNA-FISH, 형광 현장 혼성화와 함께 사용하여 단백질이 특정 서열과 관련하여 어떻게 국소화되는지 시각화할 수 있습니다.
