Denne metoden for disseksjon og immunfluorescens brukes av mange C.elegans laboratorier. Det kan tas i bruk for å oppdage ethvert protein som et antistoff eller merket fusjonsprotein er tilgjengelig for. Selv om det krever litt øvelse for å få denne disseksjonen riktig, er denne protokollen fleksibel og grei å feilsøke.
For oss fungerer DAPI-farging alltid, og vi kan vanligvis finne en tilstand som fungerer for hvert antistoff. Den største utfordringen for denne teknikken er disseksjonstrinnet. Du må jobbe raskt, men trygt for å få gode germline ekstruderinger.
Øvelse er nøkkelen. For å begynne, plasser et holdelysbilde på scenen i et dissekeringsmikroskop og legg dekselet på toppen av holdesklie. Deretter pipetter fire mikroliter av dissekeringsløsningen inn i midten av dekselet og flytt holdeglasset til den ene siden av scenen for å frigjøre utsikten.
Plukk 10 til 20 hermafroditter fra en NGM-plate i dråpen av dissekeringsløsning. Det er best å velge omtrent 10 per lysbilde, men ikke så mange at de ikke kan dissekeres innen fem minutter. For å dissekere dyrene, kryss punktene på nålene for å lage en X-form og bruk bunnen av X til å feste en voksen ned til overflaten av dekselet.
Deretter plasserer du X-formen umiddelbart bak svelget, omtrent en femtedel av kroppslengden til en ung voksen eller like under den klare delen av hodet. Deretter halshugger du dyret med en saksebevegelse, og frigjør helt fra kroppshulen, sammen med en eller begge halvdeler av tarmen. For å fikse prøven med formaldehyd, pipette fire mikroliter av fiksløsningen på dekselet, svært nær dråpen med dyr, samtidig som du unngår å pipette direkte inn i disseksjonsdråpen og forskyve de dissekerte slaktkroppene.
Fest dekselet til holdesklien med en finger. Med den andre hånden, knips forsiktig på dekselet et par ganger for å blande dråpene. Hold en positivt ladet lysbilde foran ned, bruk den til å plukke opp dekselet i midten av lysbildet ved å berøre prøvefallet forsiktig, og overflatespenningen til dråpen vil plukke opp dekselet.
Sett lysbildet på benken og fest i nøyaktig fem minutter ved romtemperatur. I løpet av denne tiden merker du lysbildet med en blyant. For å fryse sprekk prøven ved hjelp av flytende nitrogen mens du holder den merkede kanten av lysbildet med pinsett, senk den forsiktig ned i flytende nitrogen.
Slipp lysbildet, slik at det lener seg mot siden av begeret med dekselsiden opp, og lysbildene fryses innen 10 sekunder. Hvis du bruker tørris til å fryse, etter å ha skrapt frosten av overflaten av aluminiumsblokken med en barberhøvel, hold fast den merkede kanten av lysbildet og sett den på den ryddede overflaten, og trykk litt trykk nedover for å sikre full kontakt med blokken. Frysing skjer innen 10 sekunder når prøven under dekselet blir til is.
Fjern den frosne lysbildet ved å ta et godt tak i lysbildets merkede kortkant, og spenne en lang kant mot benken. Med den andre hånden, ta godt tak i en barberhøvel og skyv barberhøvelens kant nedover lysbildet for å flikke dekselet av og bort fra prøven. Legg lysbildet umiddelbart i en Coplin-krukke som inneholder 95% etanol, og la lysbildene ligge i etanol i minst fem minutter.
Vask deretter lysbildene i PBST tre ganger i fem minutter hver ved romtemperatur, mens du bruker fersk PBST for hver vask. Fluorescensavbildningsresultater av germlinekjerner viste at DAPI binder seg sterkt til DNA. Immunfluorescensfarging var effektiv når antistoffet rettet mot RAD-51, en markør for dobbeltstrengsbrudd, var tilstede som diskrete foci i miotiske kjerner, samlokalisert på kromosomer merket med DAPI.
Kle-2 heterozygotmutantene har mindre defekter i kromosomstrukturen, som vist ved lett uordnet DAPI-farging og en økning i dobbeltstrengsbruddnummer, reflektert i det høyere antallet RAD-51 foci. Både disseksjons- og frysesprekktrinnene kan være vanskelige, så det er viktig å jobbe raskt og jevnt. Vi anbefaler at du praktiserer disse trinnene før du prøver hele protokollen.
For eksempel kan du øve på å dissekere i et større volum væske, som 200 mikroliter, og gradvis jobbe ned til vårt anbefalte volum på fire mikroliter i en dekselslipp. Denne teknikken kan brukes til høyoppløselig avbildning på et konfokalt eller strukturert belysningsmikroskop, eller det kan brukes i kombinasjon med DNA eller RNA-FISH, fluorescens in situ hybridisering, for å visualisere hvordan proteiner lokaliseres i forhold til bestemte sekvenser.