Este método para dissecção e imunofluorescência é usado por muitos laboratórios C.elegans. Pode ser adotado para detectar qualquer proteína para a qual um anticorpo ou proteína de fusão marcada esteja disponível. Embora exija alguma prática para obter essa dissecação correta, esse protocolo é flexível e direto para solucionar problemas.
Para nós, a coloração DAPI sempre funciona e geralmente podemos encontrar uma condição que funcione para cada anticorpo. O maior desafio para esta técnica é a etapa de dissecação. Você tem que trabalhar rapidamente, mas com confiança, para obter boas extrusões germinativas.
A prática é fundamental. Para começar, coloque uma lâmina de retenção no palco de um microscópio de dissecação e coloque a folha de cobertura em cima da lâmina de retenção. Em seguida, pipete quatro microlitros da solução dissecante para o centro da tampa e mova a lâmina de retenção para um lado do palco para liberar a visão.
Escolher 10 a 20 hermafroditas de uma placa de NGM na gota de solução dissecante. É melhor escolher aproximadamente 10 por slide, mas não tantos que não possam ser dissecados dentro de cinco minutos. Para dissecar os animais, atravesse os pontos das agulhas para fazer uma forma de X e use a parte inferior do X para prender um adulto até a superfície da tampa.
Em seguida, posicione a forma X imediatamente atrás da faringe, cerca de um quinto do comprimento do corpo de um adulto jovem ou logo abaixo da parte clara da cabeça. Em seguida, decapite o animal com um movimento de tesoura, liberando totalmente da cavidade do corpo, juntamente com uma ou ambas as metades do intestino. Para fixar a amostra com formaldeído, pipetar quatro microlitros da solução de fixação na tampa, muito perto da gota com animais, evitando pipetar diretamente na gota de dissecção e deslocando as carcaças dissecadas.
Prenda a folha de cobertura à corrediça de retenção usando um dedo. Com a outra mão, mexa suavemente a tampa algumas vezes para misturar as gotas. Segurando um slide carregado positivamente de lado para baixo, use-o para pegar o deslizamento de cobertura no centro do slide tocando suavemente a gota de amostra, e a tensão superficial da gota pegará o deslizamento de cobertura.
Coloque o slide no banco e fixe por exatamente cinco minutos à temperatura ambiente. Durante esse tempo, rotule o slide com um lápis. Para congelar a fissura da amostra usando nitrogênio líquido enquanto segura a borda rotulada da lâmina com uma pinça, baixe-a suavemente em nitrogênio líquido.
Solte o slide, de modo que ele se incline contra o lado do copo com o lado da tampa para cima, e os slides sejam congelados dentro de 10 segundos. Se usar gelo seco para congelar, depois de raspar a geada da superfície do bloco de alumínio com uma navalha, segure firmemente a borda rotulada da lâmina e coloque-a na superfície limpa, aplicando alguma pressão para baixo para garantir o contato total com o bloco. O congelamento ocorre dentro de 10 segundos quando a amostra sob a cobertura se transforma em gelo.
Remova o slide congelado segurando firmemente a borda curta rotulada do slide e prenda uma borda longa contra o banco. Com a outra mão, segure firmemente uma navalha e deslize a borda da navalha pelo slide para afastar a tampa da amostra. Coloque imediatamente a lâmina em um frasco Coplin contendo 95% de etanol e deixe as lâminas em etanol por pelo menos cinco minutos.
Em seguida, lave as lâminas em PBST três vezes por cinco minutos cada à temperatura ambiente, enquanto usa PBST fresco para cada lavagem. Os resultados de imagens de fluorescência dos núcleos germinativos demonstraram que a DAPI se liga fortemente ao DNA. A coloração por imunofluorescência foi eficaz quando o anticorpo direcionado ao RAD-51, um marcador para quebras de fita dupla, estava presente como focos discretos dentro dos núcleos mióticos, co-localizados nos cromossomos marcados por DAPI.
Os mutantes heterozigotos kle-2 têm pequenos defeitos na estrutura cromossômica, como demonstrado pela coloração DAPI ligeiramente desordenada e um aumento no número de quebra de fita dupla, refletido no maior número de focos RAD-51. Tanto as etapas de dissecção quanto de congelamento de rachaduras podem ser complicadas, por isso é importante trabalhar de forma rápida e suave. Recomendamos praticar essas etapas antes de tentar todo o protocolo.
Por exemplo, você pode praticar a dissecação em um volume maior de líquido, como 200 microlitros, e gradualmente trabalhando até o nosso volume recomendado de quatro microlitros em um deslizamento de cobertura. Esta técnica pode ser usada para imagens de alta resolução em um microscópio de iluminação confocal ou estruturado, ou pode ser usada em combinação com DNA ou RNA-FISH, hibridização in situ por fluorescência, para visualizar como as proteínas se localizam em relação a sequências específicas.
