Этот метод диссекции и иммунофлуоресценции используется многими лабораториями C.elegans. Он может быть принят для обнаружения любого белка, для которого доступно антитело или помеченный слитый белок. Хотя для правильного рассечения требуется некоторая практика, этот протокол является гибким и простым в устранении неполадок.
Для нас окрашивание DAPI всегда работает, и мы обычно можем найти условие, которое работает для каждого антитела. Самой большой проблемой для этой техники является этап вскрытия. Вы должны работать быстро, но уверенно, чтобы получить хорошую экструзию зародышевой линии.
Практика является ключевым фактором. Для начала поместите удерживающий слайд на ступень рассекающего микроскопа и поместите крышку поверх удерживающего слайда. Затем пипетка четыре микролитра рассекающего раствора в центр чехла и перемещение удерживающего слайда в одну сторону сцены, чтобы освободить вид.
Выберите от 10 до 20 гермафродитов из пластины NGM в каплю рассекающего раствора. Лучше всего выбрать примерно 10 на слайд, но не настолько, чтобы их нельзя было препарировать в течение пяти минут. Чтобы рассечь животных, скрестите точки игл, чтобы сделать X-образную форму, и используйте нижнюю часть X, чтобы прикрепить взрослую особь к поверхности покровного листа.
Затем расположите X-образную форму непосредственно за глоткой, примерно на одну пятую длины тела молодого взрослого человека или чуть ниже прозрачной части головы. Затем обезглавить животное одним ножничным движением, полностью выпустив из полости тела вместе с одной или обеими половинками кишечника. Чтобы закрепить образец формальдегидом, пипетку четырьмя микролитрами фиксирующего раствора на крышке, очень близко к капле с животными, избегая при этом пипетки непосредственно в рассеченную каплю и смещения рассеченных туш.
Одним пальцем прикрепите крышку к удерживающему слайду. Другой рукой осторожно проведите крышкой несколько раз, чтобы перемешать капли. Удерживая положительно заряженный слайд лицевой стороной вниз, используйте его, чтобы поднять крышку в центре слайда, осторожно коснувшись капли образца, и поверхностное натяжение капли поднимет крышку.
Установите горку на скамейку и зафиксируйте ровно на пять минут при комнатной температуре. В течение этого времени пометьте слайд карандашом. Чтобы заморозить трещину образца с помощью жидкого азота, удерживая пинцетом помеченный край затвора, осторожно опустите его в жидкий азот.
Отпустите слайд так, чтобы он прислонился к боковой стороне стакана с крышкой стороной вверх, и слайды застыли в течение 10 секунд. Если использовать сухой лед для замерзания, то после соскабливания инея с поверхности алюминиевого блока бритвой, крепко удерживайте маркированный край затвора и установите его на очищенную поверхность, приложив некоторое давление вниз, чтобы обеспечить полный контакт с блоком. Замораживание происходит в течение 10 секунд, когда образец под крышкой превращается в лед.
Снимите замороженный слайд, крепко захватив короткий край слайда, и прикрепите один длинный край к скамье. Другой рукой крепко возьмите бритву и сдвиньте лезвие бритвы вниз по слайду, чтобы отвести крышку от образца. Немедленно поместите слайд в банку Coplin, содержащую 95% этанола, и оставьте слайды в этаноле не менее чем на пять минут.
Затем мойте слайды в PBST три раза в течение пяти минут каждый при комнатной температуре, используя свежий PBST для каждой стирки. Результаты флуоресцентной визуализации ядер зародышевой линии показали, что DAPI сильно связывается с ДНК. Иммунофлуоресцентное окрашивание было эффективным, когда антитело, нацеленное на RAD-51, маркер двухцепочечных разрывов, присутствовало в виде дискретных очагов в миотических ядрах, колокализованных на хромосомах, отмеченных DAPI.
Мутанты гетерозигот kle-2 имеют незначительные дефекты в структуре хромосом, о чем свидетельствует слегка неупорядоченное окрашивание DAPI и увеличение числа двухцепочечных разрывов, что отражается в большем количестве очагов RAD-51. Как рассечение, так и замораживание трещин могут быть сложными, поэтому важно работать быстро и плавно. Мы рекомендуем выполнить эти действия, прежде чем пытаться использовать весь протокол.
Например, вы можете практиковать рассечение в большем объеме жидкости, например, 200 микролитров, и постепенно работать до рекомендуемого нами объема в четыре микролитра в крышке. Этот метод может быть использован для визуализации высокого разрешения на конфокальном или структурированном осветительном микроскопе, или он может быть использован в сочетании с ДНК или РНК-FISH, флуоресцентной гибридизацией in situ, чтобы визуализировать, как белки локализуются по отношению к конкретным последовательностям.
