C. elegans Gonaddissektion och frysspricka för immunofluorescens och DAPI-färgning

Denna metod för dissektion och immunofluorescens används av många C.elegans-laboratorier. Det kan antas för att detektera vilket protein som helst som en antikropp eller taggat fusionsprotein är tillgängligt för. Även om det kräver viss övning för att få denna dissektion rätt, är detta protokoll flexibelt och enkelt att felsöka.

För oss fungerar DAPI-färgning alltid och vi kan vanligtvis hitta ett tillstånd som fungerar för varje antikropp. Den största utmaningen för denna teknik är dissektionssteget. Du måste arbeta snabbt men säkert för att få bra bakterieprofiler.

Övning är nyckeln. För att börja, placera en hållbild på scenen i ett dissekerande mikroskop och placera täckglaset ovanpå hållbilden. Pipettera sedan fyra mikroliter av dissekeringslösningen i mitten av täckglaset och flytta hållbilden till ena sidan av scenen för att frigöra vyn.

Välj 10 till 20 hermafroditer från en NGM-platta i droppen av dissekeringslösning. Det är bäst att välja cirka 10 per bild men inte så många att de inte kan dissekeras inom fem minuter. För att dissekera djuren, korsa nålarnas punkter för att göra en X-form och använd botten av X för att fästa en vuxen ner till ytan av täckglaset.

Placera sedan X-formen omedelbart bakom struphuvudet, ungefär en femtedel av kroppslängden hos en ung vuxen eller strax under den klara delen av huvudet. Halshugga sedan djuret med en saxrörelse och släpp helt från kroppshålan, tillsammans med en eller båda halvorna av tarmen. För att fixera provet med formaldehyd, pipettera fyra mikroliter av fixlösningen på täckglaset, mycket nära droppen med djur, samtidigt som man undviker att pipettera direkt i dissektionsdroppen och förskjuta de dissekerade slaktkropparna.

Fäst täckglaset på hållarbilden med ett finger. Med den andra handen, knäpp försiktigt täckglaset några gånger för att blanda dropparna. Håll en positivt laddad glid framsida nedåt, använd den för att plocka upp täckglaset i mitten av bilden genom att försiktigt röra provfallet, och ytspänningen på droppen kommer att plocka upp täckglaset.

Ställ in rutschkanan på bänken och fixa i exakt fem minuter vid rumstemperatur. Under denna tid, märk bilden med en penna. För att frysa spricka provet med flytande kväve medan du håller den märkta kanten på bilden med pincett, sänk det försiktigt till flytande kväve.

Släpp bilden, så att den lutar sig mot bägarens sida med täckglassidan uppåt, och bilderna fryses inom 10 sekunder. Om du använder torris för att frysa, efter att ha skrapat frosten från aluminiumblockets yta med en rakhyvel, håll fast den märkta kanten på bilden och ställ den på den rensade ytan och applicera lite tryck nedåt för att säkerställa full kontakt med blocket. Frysning sker inom 10 sekunder när provet under täckglaset förvandlas till is.

Ta bort den frusna rutschkanan genom att ta ett fast grepp om rutschkanans märkta kortkant och håll en lång kant mot bänken. Med den andra handen tar du ett fast tag i en rakhyvel och skjuter rakhyvelns kant nerför rutschkanan för att knäppa täckglaset av och bort från provet. Placera omedelbart bilden i en Coplin-burk som innehåller 95% etanol och lämna glasen i etanol i minst fem minuter.

Tvätta sedan bilderna i PBST tre gånger i fem minuter vardera vid rumstemperatur, medan du använder färsk PBST för varje tvätt. Fluorescensavbildningsresultat av bakteriekärnor visade att DAPI binder starkt till DNA. Immunofluorescensfärgning var effektiv när antikroppen riktad mot RAD-51, en markör för dubbelsträngsbrott, var närvarande som diskreta foci i miotiska kärnor, samlokaliserade på kromosomer markerade med DAPI.

Kle-2-heterozygotmutanterna har mindre defekter i kromosomstrukturen, vilket framgår av något oordnad DAPI-färgning och en ökning av dubbelsträngsbrytningstalet, vilket återspeglas i det högre antalet RAD-51-foci. Både dissektions- och fryssprickorna kan vara knepiga så det är viktigt att arbeta snabbt och smidigt. Vi rekommenderar att du övar dessa steg innan du försöker hela protokollet.

Du kan till exempel öva på att dissekera i en större volym vätska, som 200 mikroliter, och gradvis arbeta ner till vår rekommenderade volym på fyra mikroliter i en täckslip. Denna teknik kan användas för högupplöst avbildning på ett konfokalt eller strukturerat belysningsmikroskop, eller så kan den användas i kombination med DNA eller RNA-FISH, fluorescens in situ hybridisering, för att visualisera hur proteiner lokaliseras i förhållande till specifika sekvenser.