Name: exploring caspase mutations and post-translational modification by molecular modeling approaches
Uploaded: 2022-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן המדע הרוסית (17-75-20102, פיתוח הפרוטוקול). ניסויים המתוארים בסעיף התוצאות המייצגות (ניתוח של זרחון) נתמכו על ידי אגודות הסרטן של שטוקהולם (181301) ושוודיה (190345).

1. הכנת המערכת
הערה: המודלים המולקולריים של צורות החלבון המקוריות והמוטנטיות בנויים על בסיס מבנה גבישי מתאים המתקבל מבנק נתוני החלבון15,16.
<ol><li>כדי לאחזר את מבנה PDB שנבחר, השתמש ברשימה הנפתחת הורד קבצים ולחץ על פורמט PDB</st...

<ol>
	<li>Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+cancer.">Caspases and cancer.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).</li><li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase:+Pharmacological+manipulation+of+cell+death.">Caspase: Pharmacological manipulation of cell death.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).</li><li>Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+caspases.">A decade of caspases.</a> Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).</li><li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspases:+Activation,+specificity,+and+regulation.">Human caspases: Activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li><li>Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+caspases:+The+other+side+of+apoptosis+regulation.">Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation.</a> Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).</li><li>Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+evolution+of+phosphorylation+sites.">A mechanism for the evolution of phosphorylation sites.</a> Cell. 147 (4), 934-946 (2011).</li><li>Zamaraev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Serine-384+in+Caspase-2+processing+and+activity.">Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity.</a> Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).</li><li>Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+mutations+in+caspase-6+negatively+impact+catalytic+efficiency.">Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency.</a> Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).</li><li>Ando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+missense+mutations+of+caspase-8+activate+nuclear+factor-&#954;B+signaling.">Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-&#954;B signaling.</a> Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).</li><li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AMBER 2020. , (2020).</li><li>Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+Amber+biomolecular+simulation+package.">An overview of the Amber biomolecular simulation package.</a> WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).</li><li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTRAJ+and+CPPTRAJ:+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data.">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li><li>Maier, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ff14SB:+Improving+the+accuracy+of+protein+side+chain+and+backbone+parameters+from+ff99SB.">ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li><li>Salomon-Ferrer, R., G&#246;tz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+microsecond+molecular+dynamics+simulations+with+AMBER+on+GPUs.+2.+Explicit+solvent+particle+mesh+ewald.">Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Burley, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCSB+Protein+Data+Bank:+Powerful+new+tools+for+exploring+3D+structures+of+biological+macromolecules+for+basic+and+applied+research+and+education+in+fundamental+biology,+biomedicine,+biotechnology,+bioengineering+and+energy+sciences.">RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences.</a> Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).</li><li>Martinez, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+graphics:+Bridging+structural+biologists+and+computer+scientists.">Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists.</a> Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).</li><li>Lee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPU-accelerated+molecular+dynamics+and+free+energy+methods+in+Amber18:+Performance+enhancements+and+new+features.">GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).</li><li>J&#228;ger, R., Zwacka, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+roles+of+caspases+in+tumor+development.">The enigmatic roles of caspases in tumor development.</a> Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).</li></ol>

גישת ה-MD המתוארת מאפשרת מידול הן של צורות פראיות והן של צורות מוטנטיות של קספאז באמצעות חבילות הסימולציה הביומולקולרית. מספר נושאים חשובים של המתודולוגיה נדונים כאן. ראשית, יש לבחור מבנה גבישי מייצג של קספאז מתוך בנק נתוני החלבון. חשוב לציין שגם צורות מונומריות וגם דימריות של קספאז מקובלו...

אפופטוזיס הוא אחד התהליכים התאיים הנחקרים ביותר המווסתים את המורפוגנזה ואת ההומאוסטזיס של הרקמות של אורגניזמים רב-תאיים. אפופטוזיס יכול להיות יזום על ידי מגוון רחב של גירויים חיצוניים או פנימיים, כגון הפעלת קולטני מוות, הפרעה באותות מחזור התא, נזק לדנ"א, מתח רשתית אנדופלסמית (ER) וזיהומים חיידקיים ונגיפים שונים1. הקספאזות - שחקנים אפופטוטיים מרכזיים - מסווגות באופן מסורתי לשתי קבוצות: יוזמים (caspase-2, caspase-8, caspase-9 ו- caspase-10) ואפקטים (caspase-3, caspase-6 ו- caspase-7), בהתאם למבנה התחום שלהם ולמקום במפל הקספאזה 2,3. עם אותות המוות התאים, הקספאזות היוזם מתקשרות עם מולקולות מתאם המאפשרות דימריזציה ועיבוד אוטומטי המושרים על ידי קרבה ליצירת אנזים פעיל. הקספאזות המשפיעות מופעלות באמצעות ביקוע על ידי קספאזות יוזמות ומבצעות שלבי ביצוע במורד הזרם על ידי ביקוע מצעים תאיים מרובים4.
ההתבגרות והתפקוד של הקספאזות היוזם והאפקטים מוסדרות על ידי מספר רב של מנגנונים תוך-תאיים שונים, ביניהם השינוי שלאחר התרגום ממלא תפקיד חיוני במודולציה של מוות תאי5. תוספת של קבוצות משתנות (פוספורילציה, ניטרוסילציה, מתילציה או אצטילציה) או חלבונים (אוביקוויטינציה או SUMOylation) משנה את הפעילות האנזימטית של קספאזות או את הקונפורמציה והיציבות של החלבון המווסתות אפופטוזיס. מוטגנזה מכוונת אתר מיושמת באופן נרחב כדי לחקור את אתרי השינוי הפוטנציאליים שלאחר התרגום ולהבחין בתפקידם. אתר שינוי פוטטיבי מוחלף בדרך כלל על ידי חומצת אמינו אחרת, אשר לא ניתן לשנות עוד יותר. לפיכך, סרין ותראונין שעברו פוספורילציה עוברים מוטציה לאלנין, ואתרי יוביקוויטינציה של ליזין מוחלפים בארגינין. אסטרטגיה נוספת כוללת החלפת חומצת אמינו המחקה במיוחד שינויים לאחר תרגום (למשל, גלוטמט ואספרטט שימשו לחיקוי סרין זרחני או תראונין)6. עם זאת, חלק מהחלפות אלה הממוקמות בקרבת אתר פעיל או במיקומים קריטיים יכולות לשנות את מבנה הקספאזה, להפריע לפעילות הקטליטית ולדכא מוות תאי אפופטוטי7. השפעות דומות ניתן לראות במקרים של מוטציות missense הקשורות לגידול בגנים caspase. לדוגמה, המוטציה הקשורה לגידול של caspase-6 - R259H - גרמה לשינויים קונפורמיים של לולאות בכיס קושר המצע, והפחיתה את המחזור הקטליטי היעיל של מצעים8. תחליפי חומצות האמינו G325A ב-caspase-8 שזוהו בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר עלולים לפגוע בפעילות של קספאז-8, מה שהוביל לאפנון האיתות של גורם גרעיני-kB (NF-kB) וקידם גידולים9.
כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של תחליפי חומצות אמינו על המבנה והתפקוד של קספאז, ניתן ליישם מודלים מולקולריים. גישת הדינמיקה המולקולרית (MD) מתוארת בעבודה זו עבור מידול הקספאזה מסוג בר וצורותיו המוטנטיות באמצעות חבילת הסימולציה הביומולקולרית (Amber). שיטת MD נותנת מבט על האבולוציה הדינמית של מבנה החלבון לאחר הופעת מוטציות. חבילת אמבר, שפותחה במקור על ידי קבוצתו של פיטר קולמן, הפכה לאחד מכלי התוכנה הפופולריים ביותר לסימולציות ביומולקולריות10,11,12,13. תוכנה זו מחולקת לשני חלקים: (1) AmberTools, אוסף של תוכניות המשמשות באופן שגרתי להכנת המערכת (הקצאת סוג אטום, הוספת מימן ומולקולות מים מפורשות וכו ') וניתוח מסלול; ו-(2) ענבר, שבמרכזה תוכנית הסימולציה של pmemd. AmberTools היא חבילה חינם (ותנאי מוקדם להתקנת אמבר עצמה), בעוד אמבר מופץ עם רישיון נפרד ומבנה אגרה. סימולציות מקבילות במחשב על ו/או שימוש ביחידות עיבוד גרפיות (GPU) יכולות לשפר באופן משמעותי את הביצועים למחקר המדעי של דינמיקת מבנה חלבונים14. גרסאות התוכנה הזמינות העדכניות ביותר הן AmberTools21 ו- Amber20, אך ניתן להשתמש בפרוטוקולים המתוארים גם עם הגרסאות הקודמות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber20</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Software for molecular dynamics simulation 
			http://ambermd.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmberTools21</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Software for molecular modeling and analysis 
			http://ambermd.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring caspase mutations and post-translational modification by molecular modeling approaches

אפופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת המבטל תאים פגומים ושולט על התפתחות הומאוסטזיס רקמות של אורגניזמים רב תאיים. קספזות, משפחה של פרוטאזות ציסטאין, ממלאות תפקיד מפתח בייזום וביצוע אפופטוזיס. ההבשלה של הקספאזות ופעילותן מכווננת על ידי שינויים פוסט-תרגומיים בצורה דינמית ביותר. כדי להעריך את ההשפעה של שינויים לאחר תרגום, אתרים פוטנציאליים עוברים מוטציה שגרתית עם שאריות המתמשכות לכל שינוי. לדוגמה, שאריות הסרין מוחלפות באלנין או בחומצה אספרטית. עם זאת, תחליפים כאלה יכולים לשנות את הקונפורמציה של האתר הפעיל של הקספאזה, מה שמוביל להפרעות בפעילות הקטליטית ובתפקודים התאיים. יתר על כן, מוטציות של שאריות חומצות אמינו אחרות הממוקמות במיקומים קריטיים עלולות גם לשבור את המבנה והתפקודים של קספאזות ולהוביל להפרעות אפופטוזיס. כדי להימנע מהקשיים הכרוכים בשימוש בשאריות שעברו מוטציה, ניתן ליישם בקלות גישות של מודלים מולקולריים כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של תחליפי חומצות אמינו על מבנה הקספאז. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר מידול הן של הקספאז מסוג בר והן של הצורות המוטנטיות שלו עם חבילת הסימולציה הביומולקולרית (Amber) ומתקני מחשבי-על כדי לבחון את ההשפעה של מוטציות על המבנה והתפקוד של החלבון.

הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם בקלות במחקרים של שינוי לאחר תרגום של caspases או מוטציות פתוגניות. בחלק זה, מודגם תהליך העבודה של מידול MD (איור 1), אשר שימש בהצלחה במחקר של caspase-27. באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר במבחנה של אתרי זרחון פוטנציאליים (Ser/Thr to Ala) וגישות בי?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches at JoVE.com

Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches

הפרוטוקול הנוכחי משתמש בחבילת סימולציה ביומולקולרית ומתאר את גישת הדינמיקה המולקולרית (MD) למידול הקספאז מסוג בר וצורותיו המוטנטיות. שיטת MD מאפשרת להעריך את האבולוציה הדינמית של מבנה הקספאז ואת ההשפעה הפוטנציאלית של מוטציות או שינויים לאחר תרגום.

חקר מוטציות קספזיות ושינוי פוסט-תרגומי על ידי גישות מידול מולקולריות

Apoptosis is a type of programmed cell death that eliminates damaged cells and controls the development and tissue homeostasis of multicellular organisms. ...

למלא תפקיד מפתח בייזום וביצוע באמצעות מודלים מולקולריים. אנו חוקרים את ההשפעה של שינויים ומוטציות לאחר התרגום על המבנה והתפקוד של Caspase. אנו מתארים את גישת הדינמיקה המולקולרית הנותנת מבט על האבולוציה של החלבון, בעקבות הכנסת שינויים מבניים ברמה האטומית.גישה כזו היא בעלת משמעות מיוחדת להבנת המנגנונים המווסתים את המוות התאי בתוכנית ואת ההפרעות הנלוות אליו ולפיתוח טיפולים יעילים חדשים. אנו מדגימים יכולות מידול מולקולרי עם אחד הכלים הפופולריים ביותר, Amber 20. אבל הפרוטוקול המוצג יכול לשמש גם עם הגרסאות הרשמיות של תוכנה זו.הסרטון הבא מתאר צעד אחר צעד הוראות להכנת מבנה Caspase לסימולציה וביצוע חקירה אסקיליקה של חלבונים אלה סוג פראי וצורות שונות. כדי לאחזר את בנק נתוני החלבון שנבחר או את מבנה P D B, השתמש ברשימה הנפתחת של קבצי ההורדה ולחץ על פורמט P D B. הסר הערות ונתוני קישוריות והכנס כרטיס T E R בין שרשראות חלבונים נפרדות בקובץ P D B.כדי להכין את המודל ההתחלתי הפעל את תוכנית T-LEAP מחבילת Amber Tools. לאחר מכן טען את שדה הכוח F F 14 S B כדי לתאר את החלבון עם מכניקה מולקולרית ואת הפרמטרים עבור מולקולות מים ויונים אטומיים כגון נתרן וכלוריד על ידי הזנת הפקודות שצוינו בשורת הפקודה. לאחר מכן, טען את קובץ P D B ובנה קואורדינטות עבור מימן היוצר אובייקט בשם מול.בדוק אם יש חוסר עקביות פנימי שעלול לגרום לבעיות באמצעות הפקודה check mol. צרו קופסת ממס סביב החלבון. לאחר מכן בדוק את המטען הכולל על ידי הזנת מטען מול והוסף יונים נגדיים כדי לנטרל את המערכת.צור את הקובץ העליון טופולוגיה P R M ואת קובץ הקואורדינטות I N P C R D על ידי הזנת הפקודה המצוינת. לאחר שתסיים, צא מתוכנית T-lEAP. בצע את השלב הראשון של מזעור האנרגיה כדי לייעל את מיקומם של אטומי מימן נוספים ומולקולות מים תוך שמירה על קואורדינטות החלבון קבועות על ידי ריסון מיקום על אטומים כבדים.הפעל את התוכנית P M E M D על-ידי הזנת הפקודה שצוינה. בצע את הארגומנטים הנדרשים בזמן שאני שולט בנתונים. טופולוגיה מולקולרית P, פרמטרים של שדות כוח ושמות אטומים.C קואורדינטות ראשוניות. O פלט יומן קריא למשתמש R קואורדינטות סופיות. REF, קואורדינטות ייחוס עבור ריסון מיקום.לאחר מכן, לבצע את השלב השני של מזעור האנרגיה ללא ריסון כדי לייעל את המערכת כולה באמצעות קלטים של הפקודה ציין. שלב זה נועד לחמם את המערכת מאפס עד 300 קלווין. בצע את תהליך החימום עם ריסון מיקום על אטומי החלבון עם 50 פיקו-שניות בנפח קבוע על ידי שימוש בפקודה הנתונה כקלט.עקוב אחר הארגומנט הנדרש כאשר קבוצות קואורדינטות X נשמרות על מסלול הדינמיקה המולקולרית. השלב הבא הוא הכרחי כדי להתאים את צפיפות המים ולקבל את מצב שיווי המשקל של החלבון. בצע את שיווי המשקל ב 300 קלווין עבור 500 פיקו-שניות בלחץ קבוע ללא כל ריסון באמצעות הפקודה המצוינת לאחר שיווי משקל הושג בהצלחה.בצע סימולציה של דינמיקה מולקולרית לייצור במשך 10 ננו-שניות או יותר בלחץ קבוע וצור את קובץ המסלול לניתוח הבא של מבנה החלבון באמצעות הפקודה שצוינה. הגרסה המקבילה של התוכנית, P M E M D M P I או G P U גרסה מואצת P M E M D CUDA יכולה לשמש באשכולות מחשבים ומחשבי על. סימולציה ארוכה של דינמיקה מולקולרית עשויה להיות מחולקת למספר מקטעים ולהתבצע ברצף.בניתוח זה, סוג פראי Caspase two ומוטנט הסרין-384 אלנין שלו נחקרו בעקבות תהליך העבודה של מידול הדינמיקה המולקולרית. החלפת הסרין-384 אלנין גרמה לשינוי קונפורמי חשוב בשאריות האתר הפעיל ארגינין-378. יתר על כן, הוכח כי החלפת הסרין-384 אלנין השפיעה על זיהוי המצע על ידי שאריות הארגינין באתר הפעיל ופגעה בפעילות בסיס היצוק.האתר ביים מוטגנזה ובדיקות ביוכימיות הראו כי מוטציית סרין-384 אלנין חסמה את הפעילות האנזימטית בעיבוד של Caspase two ודיכאה את האפופטוזיס של תאים סרטניים. ניתן להשתמש בגישה המתוארת כדי להעריך את ההשפעה של מוטציות בחומצות אמינו ושינויים פוסט-תרגומיים בקספאז 2, כמו גם בקספאז אחרים המעורבים במחלות סרטן שונות.

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Approaches to Tissue Engineering

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...