Name: exploring caspase mutations and post-translational modification by molecular modeling approaches
Uploaded: 2022-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches at JoVE.com

この研究は、ロシア科学財団(17-75-20102、プロトコル開発)からの助成金によってサポートされました。代表的な結果のセクション(リン酸化の分析)に記載されている実験は、ストックホルム(181301)およびスウェーデン(190345)癌協会によってサポートされました。

1. システムの準備
注:天然および変異タンパク質形態の分子モデルは、タンパク質データバンク15,16から得られた適切な結晶構造に基づいて構築されています。
<ol><li>選択したPDB構造を取得するには、[ ファイルのダウンロード ]ドロップダウンリストを使用して、[ PDB形式]をクリックしま...

<ol>
	<li>Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+cancer.">Caspases and cancer.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).</li><li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase:+Pharmacological+manipulation+of+cell+death.">Caspase: Pharmacological manipulation of cell death.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).</li><li>Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+caspases.">A decade of caspases.</a> Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).</li><li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspases:+Activation,+specificity,+and+regulation.">Human caspases: Activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li><li>Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+caspases:+The+other+side+of+apoptosis+regulation.">Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation.</a> Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).</li><li>Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+evolution+of+phosphorylation+sites.">A mechanism for the evolution of phosphorylation sites.</a> Cell. 147 (4), 934-946 (2011).</li><li>Zamaraev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Serine-384+in+Caspase-2+processing+and+activity.">Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity.</a> Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).</li><li>Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+mutations+in+caspase-6+negatively+impact+catalytic+efficiency.">Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency.</a> Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).</li><li>Ando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+missense+mutations+of+caspase-8+activate+nuclear+factor-&#954;B+signaling.">Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-&#954;B signaling.</a> Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).</li><li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AMBER 2020. , (2020).</li><li>Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+Amber+biomolecular+simulation+package.">An overview of the Amber biomolecular simulation package.</a> WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).</li><li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTRAJ+and+CPPTRAJ:+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data.">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li><li>Maier, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ff14SB:+Improving+the+accuracy+of+protein+side+chain+and+backbone+parameters+from+ff99SB.">ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li><li>Salomon-Ferrer, R., G&#246;tz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+microsecond+molecular+dynamics+simulations+with+AMBER+on+GPUs.+2.+Explicit+solvent+particle+mesh+ewald.">Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Burley, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCSB+Protein+Data+Bank:+Powerful+new+tools+for+exploring+3D+structures+of+biological+macromolecules+for+basic+and+applied+research+and+education+in+fundamental+biology,+biomedicine,+biotechnology,+bioengineering+and+energy+sciences.">RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences.</a> Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).</li><li>Martinez, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+graphics:+Bridging+structural+biologists+and+computer+scientists.">Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists.</a> Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).</li><li>Lee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPU-accelerated+molecular+dynamics+and+free+energy+methods+in+Amber18:+Performance+enhancements+and+new+features.">GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).</li><li>J&#228;ger, R., Zwacka, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+roles+of+caspases+in+tumor+development.">The enigmatic roles of caspases in tumor development.</a> Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).</li></ol>

記載されたMDアプローチは、生体分子シミュレーションパッケージを使用して、野生型および変異型の両方のカスパーゼをモデル化することを可能にする。ここでは、方法論のいくつかの重要な問題について説明します。まず、カスパーゼの代表的な結晶構造をタンパク質データバンクから選択する必要があります。重要なことに、カスパーゼの単量体および二量体形態の両方が許容される?...

アポトーシスは、多細胞生物の形態形成と組織恒常性を調節する最も広く研究されている細胞プロセスの1つです。アポトーシスは、死受容体の活性化、細胞周期シグナルの乱れ、DNA損傷、小胞体(ER)ストレス、さまざまな細菌およびウイルス感染など、広範囲の外部または内部刺激によって開始される可能性があります1。カスパーゼ(主要なアポトーシスプレーヤー)は、ドメイン構造とカスパーゼカスケード2,3の場所に応じて、従来、イニシエーター(カスパーゼ-2、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-10)とエフェクター(カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7)の2つのグループに分類されます。細胞死シグナルにより、開始剤カスパーゼはアダプター分子と相互作用し、近接誘導二量体化および自動処理を促進して活性酵素を形成します。エフェクターカスパーゼは、開始剤カスパーゼによる切断を介して活性化され、複数の細胞基質4を切断することによって下流の実行ステップを実行する。
開始剤およびエフェクターカスパーゼの成熟および機能は、多数の異なる細胞内メカニズムによって調節されており、その中で翻訳後修飾は細胞死調節に不可欠な役割を果たす5。修飾基(リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化)またはタンパク質(ユビキチン化またはSUMO化)の付加は、カスパーゼの酵素活性またはアポトーシスを調節するタンパク質の立体構造および安定性を変化させます。部位特異的突然変異誘発は、潜在的な翻訳後修飾部位を調査し、それらの役割を識別するために広く適用されています。推定修飾部位は通常、別のアミノ酸に置き換えられますが、これはさらに修飾することはできません。したがって、潜在的にリン酸化されたセリンおよびスレオニンはアラニンに変異し、リジンユビキチン化部位はアルギニンに置換される。別の戦略は、特に翻訳後修飾を模倣するアミノ酸を置換することを含む(例えば、リン酸化セリンまたはスレオニンを模倣するために使用されているグルタミン酸およびアスパラギン酸)6。しかし、活性部位の高い近傍または臨界位置に位置するこれらの置換のいくつかは、カスパーゼ構造を変化させ、触媒活性を乱し、アポトーシス細胞死を抑制する可能性があります7。同様の効果は、カスパーゼ遺伝子における腫瘍関連ミスセンス変異の場合にも観察され得る。例えば、カスパーゼ−6−R259H−の腫瘍関連変異は、基質結合ポケット内のループの立体構造変化をもたらし、基質8の効率的な触媒代謝回転を減少させた。頭頸部扁平上皮癌で同定されたカスパーゼ-8のG325Aアミノ酸置換は、カスパーゼ-8活性を阻害し、核因子-kB(NF-kB)シグナル伝達の調節につながり、腫瘍形成を促進しました9。
カスパーゼの構造と機能に対するアミノ酸置換の潜在的な影響を評価するために、分子モデリングを適用することができます。分子動力学(MD)アプローチは、生体分子シミュレーションパッケージ(Amber)を使用して野生型カスパーゼとその変異型をモデル化するためのこの研究で説明されています。MD法は、突然変異の導入後のタンパク質構造の動的進化のビューを提供します。もともとPeter Kollmanのグループによって開発されたAmberパッケージは、生体分子シミュレーション用の最も人気のあるソフトウェアツールの1つになりました10,11,12,13。このソフトウェアは2つの部分に分かれています:(1)AmberTools、システムの準備(原子タイプの割り当て、水素と明示的な水分子の追加など)と軌道分析に日常的に使用されるプログラムのコレクション。(2)pmemdシミュレーションプログラムを中心とするアンバー。AmberTools は無料のパッケージ (および Amber 自体をインストールするための前提条件) ですが、Amber は別のライセンスと料金体系で配布されます。スーパーコンピュータ上での並列シミュレーションやグラフィックスプロセッシングユニット(GPU)の使用により、タンパク質構造ダイナミクスの科学的研究のパフォーマンスを大幅に向上させることができます14。利用可能な最新のソフトウェアバージョンはAmberTools21とAmber20ですが、説明されているプロトコルは以前のバージョンでも使用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber20</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Software for molecular dynamics simulation 
			http://ambermd.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmberTools21</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Software for molecular modeling and analysis 
			http://ambermd.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring caspase mutations and post-translational modification by molecular modeling approaches

アポトーシスは、損傷した細胞を排除し、多細胞生物の発生と組織の恒常性を制御するプログラムされた細胞死の一種です。システインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼは、アポトーシスの開始と実行において重要な役割を果たします。カスパーゼの成熟とその活性は、非常に動的な方法で翻訳後修飾によって微調整されます。翻訳後変化の影響を評価するために、潜在的な部位は、修飾に永続的な残基で日常的に変異されます。例えば、セリン残基はアラニンまたはアスパラギン酸で置換される。しかし、そのような置換はカスパーゼ活性部位の立体構造を変化させ、触媒活性および細胞機能の障害をもたらす可能性がある。さらに、重要な位置に位置する他のアミノ酸残基の突然変異もカスパーゼの構造と機能を破壊し、アポトーシス摂動を引き起こす可能性があります。変異残基を採用することの難しさを回避するために、分子モデリングアプローチを容易に適用して、カスパーゼ構造に対するアミノ酸置換の潜在的な影響を推定することができます。本プロトコルは、生物分子シミュレーションパッケージ(Amber)とスーパーコンピューター機能を使用して野生型カスパーゼとその変異型の両方をモデル化し、タンパク質の構造と機能に対する突然変異の影響をテストすることを可能にします。

本プロトコルは、カスパーゼまたは病原性変異の翻訳後修飾の研究に容易に適用することができる。このセクションでは、カスパーゼ-2の研究で成功裏に使用されているMDモデリングワークフローが示されています(図1)。潜在的なリン酸化部位(Ser/ThrからAla)のin vitro部位特異的突然変異誘発と生化学的アプローチを使用して、Ser384Ala変異がカスパ?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches at JoVE.com

Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches

本プロトコルは、生体分子シミュレーションパッケージを使用し、野生型カスパーゼおよびその変異形態をモデル化するための分子動力学(MD)アプローチを記載する。MD法は、カスパーゼ構造の動的進化および突然変異または翻訳後修飾の潜在的な影響を評価することを可能にする。

分子モデリングアプローチによるカスパーゼ変異と翻訳後修飾の探索

Apoptosis is a type of programmed cell death that eliminates damaged cells and controls the development and tissue homeostasis of multicellular organisms. ...

分子モデリングを使用した開始と実行において重要な役割を果たします。翻訳後修飾と突然変異がカスパーゼの構造と機能に及ぼす影響を研究しています。原子レベルでの構造修飾の導入に続くタンパク質の進化を視野に入れる分子動力学アプローチについて説明します。このようなアプローチは、プログラム細胞死および関連する障害を調節するメカニズムを理解し、新しい効果的な治療法を開発する上で特に重要です。最も一般的なツールの1つであるAmber 20を使用して、分子モデリング機能を実証します。ただし、提示されたプロトコルは、このソフトウェアの正式なバージョンでも使用できます。次のビデオでは、シミュレーション用のカスパーゼ構造を準備し、このタンパク質の野生型および修飾型のアシリカ調査を実行する手順を段階的に説明します。選択したタンパク質データバンクまたはPDB構造を取得するには、ダウンロードファイルのドロップダウンリストを使用して、P D B形式をクリックします。注釈と接続データを削除し、PDBファイル内の別々のタンパク質鎖の間にT E Rカードを挿入します。開始モデルを準備するには、アンバーツールパッケージからT-LEAPプログラムを起動します。次に、F 14 S B力場をロードして、コマンドラインに示されたコマンドを入力して、分子力学と水分子とナトリウムや塩化物などの原子イオンのパラメータでタンパク質を記述します。次に、P D Bファイルをロードし、水素の座標を構築してmolという名前のオブジェクトを作成します。check molコマンドを使用して、問題を引き起こす可能性のある内部不整合を確認します。タンパク質の周りに溶媒ボックスを作成します。次に、電荷molを入力して総電荷を確認し、対イオンを追加して系を中和します。指定されたコマンドを入力して、トポロジ P R M トップ ファイルと座標 I N P C R D ファイルを作成します。完了したら、T-lEAPプログラムを終了します。エネルギー最小化の第1段階を実行して、重原子の位置拘束によってタンパク質座標を固定しながら、追加された水素原子と水分子の位置を最適化します。示されたコマンドを入力して、P M E M D プログラムを実行します。データを制御するときに必要な引数に従ってください。P分子トポロジー、力場パラメータ、原子名。C の初期座標。O ユーザーが読み取り可能なログ出力 R 最終座標。REF、位置拘束の参照座標。次に、エネルギー最小化の第2段階を制約なしで実行し、指定されたコマンドの入力を使用してシステム全体を最適化します。この段階は、システムを0ケルビンから300ケルビンに加熱することを目的としています。与えられたコマンドを入力として、一定体積で50ピコ秒でタンパク質原子の位置拘束で加熱プロセスを実行します。分子動力学軌道上に保存されたX座標セットとして、必要な引数に従います。次の段階は、水の密度を調整し、タンパク質の平衡状態を得るために必要である。平衡が正常に達成された後、示されたコマンドを使用して、一定の圧力で300ケルビンで500ピコ秒の平衡化を拘束なしで実行します。一定の圧力で10ナノ秒以上の生産分子動力学シミュレーションを実行し、示されたコマンドを使用してタンパク質構造の後続の分析のための軌道ファイルを生成します。プログラムの並列バージョンであるP M E M D M P IまたはG P U 加速版P M E M D cudaは、コンピュータクラスタおよびスーパーコンピュータで使用できます。長い分子動力学シミュレーションは、いくつかのセグメントに分割され、順番に実行される場合があります。この解析では、野生型カスパーゼ2とそのセリン-384アラニン変異体を分子動力学モデリングワークフローに従って調査しました。セリン-384アラニン置換は、活性部位残基アルギニン-378に重要な立体配座変化を誘導した。さらに、セリン-384アラニン置換は、キャスト塩基活性を損なう活性部位のアルギニン残基による基質認識に影響を与えることが示された。部位指向突然変異誘発および生化学的試験は、セリン-384アラニン変異がカスパーゼ2のプロセシングにおける酵素活性をブロックし、癌細胞のアポトーシスを抑制することを示した。記載されたアプローチは、カスパーゼ2ならびに様々な癌疾患に関与する他のカスパーゼにおけるアミノ酸突然変異および翻訳後修飾の影響を評価するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Approaches to Tissue Engineering

組織工学への実験的アプローチ

生物学

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...