Name: exploring caspase mutations and post-translational modification by molecular modeling approaches
Uploaded: 2022-10-13T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Russa de Ciência (17-75-20102, o desenvolvimento do protocolo). Os experimentos descritos na seção de resultados representativos (análise da fosforilação) foram apoiados pelas Sociedades de Câncer de Estocolmo (181301) e Suécia (190345).

1. Preparação do sistema
NOTA: Os modelos moleculares das formas proteicas nativas e mutantes são construídos com base em uma estrutura cristalina apropriada obtida do Protein Data Bank15,16.
<ol><li>Para recuperar a estrutura PDB selecionada, use a lista suspensa Baixar arquivos e clique em Formato PDB. Remova comentários e dados de conectividade e insira um cartão TER entre c...

<ol>
	<li>Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+cancer.">Caspases and cancer.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).</li><li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase:+Pharmacological+manipulation+of+cell+death.">Caspase: Pharmacological manipulation of cell death.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).</li><li>Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+caspases.">A decade of caspases.</a> Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).</li><li>Pop, C., Salvesen, G. 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A abordagem MD descrita permite modelar as formas selvagens e mutantes de caspase usando os pacotes de simulação biomolecular. Várias questões importantes da metodologia são discutidas aqui. Primeiro, uma estrutura cristalina representativa da caspase precisa ser selecionada do Banco de Dados de Proteínas. É importante ressaltar que as formas monomérica e dimérica de caspase são aceitáveis. Escolher estruturas de alta resolução com um número mínimo de resíduos ausentes é uma boa ideia. O estado de proton...

A apoptose é um dos processos celulares mais amplamente estudados que regulam a morfogênese e a homeostase tecidual de organismos multicelulares. A apoptose pode ser iniciada por uma ampla gama de estímulos externos ou internos, como a ativação de receptores de morte, distúrbios nos sinais do ciclo celular, danos ao DNA, estresse do retículo endoplasmático (RE) e várias infecções bacterianas e virais1. As caspases - principais atores apoptóticos - são convencionalmente classificadas em dois grupos: iniciadores (caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10) e efetores (caspase-3, caspase-6 e caspase-7), dependendo de sua estrutura de domínio e do lugar na cascata da caspase 2,3. Após os sinais de morte celular, as caspases iniciadoras interagem com moléculas adaptadoras que facilitam a dimerização induzida pela proximidade e o autoprocessamento para formar uma enzima ativa. As caspases efetoras são ativadas através de clivagem por caspases iniciadoras e realizam etapas de execução a jusante por clivagem múltiplos substratos celulares4.
A maturação e a função das caspases iniciadora e efetora são reguladas por um grande número de diferentes mecanismos intracelulares, dentre os quais a modificação pós-translacional desempenha um papel indispensável na modulação da morte celular5. A adição de grupos modificadores (fosforilação, nitrosilação, metilação ou acetilação) ou proteínas (ubiquitinação ou SUMOilação) altera a atividade enzimática das caspases ou a conformação e estabilidade proteica que regulam a apoptose. A mutagênese dirigida ao site é amplamente aplicada para investigar os possíveis locais de modificação pós-translacional e discernir seu papel. Um suposto local de modificação é geralmente substituído por outro aminoácido, que não pode ser modificado ainda mais. Assim, serina e treonina potencialmente fosforiladas são mutadas para alanina, e os locais de ubiquitinação de lisina são substituídos por arginina. Outra estratégia inclui a substituição de um aminoácido que imita particularmente a modificação pós-translacional (por exemplo, glutamato e aspartato têm sido usados para imitar serina fosforilada ou treonina)6. No entanto, algumas dessas substituições localizadas na alta vizinhança de um sítio ativo ou em posições críticas podem alterar a estrutura da caspase, perturbar a atividade catalítica e suprimir a morte celular apoptótica7. Efeitos semelhantes podem ser observados em casos de mutações missense associadas a tumores em genes caspase. Por exemplo, a mutação tumoral associada à caspase-6 - R259H - resultou em alterações conformacionais de alças na bolsa de ligação ao substrato, reduzindo o eficiente turnover catalítico dos substratos8. A substituição do aminoácido G325A na caspase-8 identificada no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço poderia dificultar a atividade da caspase-8, o que levou à modulação da sinalização do fator nuclear kB (NF-kB) e promoveu a tumorigênese9.
Para avaliar o efeito potencial das substituições de aminoácidos na estrutura e função da caspase, a modelagem molecular pode ser aplicada. A abordagem da dinâmica molecular (MD) é descrita neste trabalho para modelar a caspase do tipo selvagem e suas formas mutantes usando o pacote de simulação biomolecular (Amber). O método MD fornece uma visão da evolução dinâmica da estrutura da proteína após a introdução de mutações. Originalmente desenvolvido pelo grupo de Peter Kollman, o pacote Amber tornou-se uma das ferramentas de software mais populares para simulações biomoleculares10,11,12,13. Este software é dividido em duas partes: (1) AmberTools, uma coleção de programas rotineiramente utilizados para a preparação do sistema (atribuição de tipo de átomo, adição de hidrogênios e moléculas de água explícita, etc.) e análise de trajetória; e (2) Âmbar, que é centrado em torno do programa de simulação pmemd. O AmberTools é um pacote gratuito (e um pré-requisito para instalar o próprio Amber), enquanto o Amber é distribuído com uma estrutura separada de licenças e taxas. Simulações paralelas em um supercomputador e/ou utilizando unidades de processamento gráfico (GPUs) podem melhorar substancialmente o desempenho para a pesquisa científica da dinâmica da estrutura de proteínas14. As versões de software mais recentes disponíveis são AmberTools21 e Amber20, mas os protocolos descritos também podem ser usados com as versões anteriores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber20</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Software for molecular dynamics simulation 
			http://ambermd.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmberTools21</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td>Software for molecular modeling and analysis 
			http://ambermd.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring caspase mutations and post-translational modification by molecular modeling approaches

A apoptose é um tipo de morte celular programada que elimina células danificadas e controla o desenvolvimento e a homeostase tecidual de organismos multicelulares. Caspases, uma família de proteases de cisteína, desempenham um papel fundamental na iniciação e execução da apoptose. A maturação das caspases e sua atividade é ajustada por modificações pós-traducionais de forma altamente dinâmica. Para avaliar o efeito das alterações pós-translacionais, os locais potenciais são rotineiramente mutados com resíduos persistentes a quaisquer modificações. Por exemplo, o resíduo de serina é substituído por alanina ou ácido aspártico. No entanto, tais substituições poderiam alterar a conformação do sítio ativo da caspase, levando a distúrbios na atividade catalítica e nas funções celulares. Além disso, mutações de outros resíduos de aminoácidos localizados em posições críticas também podem quebrar a estrutura e as funções das caspases e levar à perturbação da apoptose. Para evitar as dificuldades de empregar resíduos mutantes, abordagens de modelagem molecular podem ser prontamente aplicadas para estimar o efeito potencial das substituições de aminoácidos na estrutura da caspase. O presente protocolo permite a modelagem tanto da caspase do tipo selvagem quanto de suas formas mutantes com o pacote de simulação biomolecular (Amber) e instalações de supercomputador para testar o efeito de mutações na estrutura e função da proteína.

O presente protocolo pode ser prontamente aplicado em estudos de modificação pós-translacional de caspases ou mutações patogênicas. Nesta seção, é ilustrado o fluxo de trabalho de modelagem de DM (Figura 1), que tem sido utilizado com sucesso no estudo da caspase-27. Usando mutagênese in vitro direcionada ao local de potenciais sítios de fosforilação (Ser/Thr a Ala) e abordagens bioquímicas, demonstrou-se que a mutação Ser384Ala impediu o proc...

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Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches

O presente protocolo utiliza um pacote de simulação biomolecular e descreve a abordagem de dinâmica molecular (MD) para modelar a caspase do tipo selvagem e suas formas mutantes. O método MD permite avaliar a evolução dinâmica da estrutura da caspase e o efeito potencial de mutações ou modificações pós-traducionais.

Explorando mutações da caspase e modificação pós-translacional por abordagens de modelagem molecular

Apoptosis is a type of programmed cell death that eliminates damaged cells and controls the development and tissue homeostasis of multicellular organisms. ...

desempenham um papel fundamental na iniciação e execução usando modelagem molecular. Estudamos o efeito de modificações e mutações pós-tradução na estrutura e função da caspase. Descrevemos a abordagem da dinâmica molecular que dá uma visão da evolução da proteína, após a introdução de modificações estruturais no nível atômico.Tal abordagem é um significado particular para a compreensão dos mecanismos que regulam a morte celular do programa e distúrbios associados e o desenvolvimento de novas terapias eficazes. Demonstramos capacidades de modelagem molecular com uma das ferramentas mais populares, Amber 20. Mas o protocolo apresentado também pode ser usado com as versões formais deste software.O vídeo a seguir descreve instruções passo a passo sobre a preparação da estrutura da Caspase para simulação e a realização de uma investigação ascilica deste tipo selvagem de proteínas e formas modificadas. Para recuperar o banco de dados de proteína selecionado ou a estrutura P D B, use a lista suspensa de arquivos de download e clique no formato P D B. Remova observações e dados de conectividade e insira um cartão T E R entre cadeias de proteínas separadas no arquivo P D B.Para preparar o modelo inicial, inicie o programa T-LEAP do pacote Amber Tools. Em seguida, carregue o campo de força F F 14 S B para descrever a proteína com mecânica molecular e os parâmetros para moléculas de água e íons atômicos, como sódio e cloreto, inserindo os comandos indicados na linha de comando. Em seguida, carregue o arquivo P D B e construa coordenadas para hidrogênios criando um objeto chamado mol.Verifique se há inconsistências internas que possam causar problemas usando o comando check mol. Crie uma caixa de solvente ao redor da proteína. Em seguida, verifique a carga total inserindo mol de carga e adicione íons contadores para neutralizar o sistema.Crie o arquivo de topologia P R M top e a coordenada I N P C R D digitando o comando indicado. Uma vez feito, feche o programa T-lEAP. Realizar o primeiro estágio da minimização de energia para otimizar as posições dos átomos de hidrogênio e moléculas de água adicionados, mantendo as coordenadas de proteína fixadas por restrições posicionais em átomos pesados.Execute o programa P M E M D inserindo o comando indicado. Siga os argumentos necessários enquanto controlo os dados. P topologia molecular, parâmetros de campo de força e nomes de átomos.Coordenadas iniciais C. O usuário legível log saída R coordenadas finais. REF, coordenadas de referência para restrições de posição.Em seguida, realize o segundo estágio da minimização de energia sem restrições para otimizar todo o sistema usando as entradas do comando indicado. Esta etapa visa aquecer o sistema de zero a 300 kelvins. Realizar o processo de aquecimento com restrições posicionais nos átomos de proteína com 50 picossegundos em volume constante, usando o comando dado como entradas.Siga o argumento necessário como X conjuntos de coordenadas salvos ao longo da trajetória da dinâmica molecular. O próximo estágio é necessário para ajustar a densidade da água e obter o estado de equilíbrio da proteína. Efectuar o equilíbrio a 300 kelvins durante 500 picossegundos a pressão constante, sem quaisquer restrições, utilizando o comando indicado após o equilíbrio ter sido alcançado com êxito.Realizar uma simulação de dinâmica molecular de produção por 10 nanossegundos ou mais a pressão constante e gerar o arquivo de trajetória para posterior análise da estrutura proteica usando o comando indicado. A versão paralela do programa, P M E M D M P I ou G P U versão acelerada P M E M D cuda pode ser usada em clusters de computadores e supercomputadores. Uma longa simulação de dinâmica molecular pode ser dividida em vários segmentos e realizada sequencialmente.Nesta análise, a Caspase dois do tipo selvagem e seu mutante Serina-384 alanina foram investigados seguindo o fluxo de trabalho de modelagem de dinâmica molecular. A substituição de serina-384 alanina induziu importante alteração conformacional no resíduo do sítio ativo Arginina-378. Além disso, foi demonstrado que a substituição de serina-384 alanina afetou o reconhecimento do substrato pelos resíduos de arginina no sítio ativo, prejudicando a atividade de base fundida.A mutagênese direcionada ao local e os testes bioquímicos demonstraram que a mutação Serina-384 alanina bloqueou a atividade enzimática no processamento da Caspase dois e suprimiu a apoptose das células cancerígenas. A abordagem descrita pode ser usada para avaliar o efeito de mutações de aminoácidos e modificações pós-traducionais na caspase dois, bem como em outras caspase envolvidas em várias doenças cancerígenas.

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Abordagens experimentais de Engenharia de Tecidos

Biologia

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