Name: multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

تم تكريم كيلي أوبرتين وفابيان بيكو من منشأة IVETh الأساسية (باريس) لتجارب تصوير رامان. تم الاعتراف بتييري بورنوف (جامعة تايبيه الطبية ، تايوان) وزوزانا كروبوفا (من هيلينكورت ، فرنسا) لتقديمهما عينات EV المشتقة من عينات الصفائح الدموية وحليب الأبقار ، على التوالي. تم دعم العمل من قبل منطقة بورغون فرانش كونتيه وكلية الدراسات العليا EUR EIPHI (مشروع NOVICE ، 2021-2024). تم إنجاز جزء من هذا العمل باستخدام منصة CLIPP وفي مرافق الغرف النظيفة RENATECH في FEMTO-ENGINEERING ، والتي نشكر عليها رابح زقاري.

1. إعداد الركيزة الذهبية
ملاحظة: يتم إنتاج ثلاثة أنواع من الأسطح على رقائق الذهب: 1) سطح عاري ، 2) وظيفي كيميائيا ، و 3) وظيفي حيوي (روابط مطعمة على طبقة C11C16). سيطلق عليهم "عارية" و "C11C16" و "روابط" على التوالي ، من هذه النقطة فصاعدا.
<ol><li>إعداد الر...

<ol>
	<li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products:+A+position+paper+of+the+group+&amp;#34;Extracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France&amp;#34;.">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &amp;#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&amp;#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).</li><li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes.">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li><li>Hartjes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+vesicles+as+emerging+theranostic+nanoplatforms.">Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms.</a> Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).</li><li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations.">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).</li><li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Definition,+isolation+and+characterization.">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li><li>Brisson, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+activated+platelets:+A+semiquantitative+cryo-electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+study.">Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study.</a> Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+A+novel+approach+to+the+detection+of+nanosized+blood+microparticles.">Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).</li><li>Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., P&#233;try, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensional+characterization+of+extracellular+vesicles+using+atomic+force+microscopy.">Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy.</a> Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).</li><li>Beekman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-capture+of+extracellular+vesicles+for+individual+multi-modal+characterization+using+AFM,+SEM+and+Raman+spectroscopy.">Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy.</a> Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).</li><li>Malenica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+microscopy+methods+for+morphology+characterisation+of+extracellular+vesicles+from+human+biofluids.">Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids.</a> Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo.">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion:+A+tool+to+improve+transfusion+safety.">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+&#171;on-chip&#187;+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles.">Development of a NanoBioAnalytical platform for &#171;on-chip&#187; qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li><li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles.">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li><li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis.">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).</li><li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM:+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM.">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).</li><li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicle+(EV)+Array:+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping.">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).</li><li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+(SUPRA-MS):+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma.">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li><li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+lipids:+A+review.">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li><li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers.">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li><li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing.">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li><li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging.">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246 (2016).</li><li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles.">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li></ol>

الطرق الحديثة لتحديد EV الأكثر استخداما هي النشاف المناعي الخاص بالبروتين لتأكيد أصل EVs ، TEM لتأكيد هيكلها ، و NTA لتحديد توزيعها على العدد والحجم في حجم العينة3. ومع ذلك ، فإن الاهتمام الكبير بالمركبات الكهربائية في البحوث الطبية (الحيوية) والقيود المفروضة على الأدوات التحليلية...

أدى الاهتمام المتزايد بأبحاث EV في التشخيص والعلاجات1،2،3،4،5 ، جنبا إلى جنب مع التحديات التي يواجهها هذا المجال ، إلى تطوير وتنفيذ مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأساليب والتقنيات لتحديد أو توصيف هذه الحويصلات. الطرق الأكثر استخداما لتحديد EV هي النشاف المناعي الخاص بالبروتين والبروتينات لتأكيد أصل EVs ، والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتأكيد هيكلها ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لتحديد عددها وتوزيع حجمها في حجم العينة.
ومع ذلك ، لا تقدم أي من هذه التقنيات بمفردها جميع المعلومات المطلوبة لتوصيف المجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية. إن عدم التجانس المتأصل في المركبات الكهربائية بسبب التنوع في خصائصها البيوكيميائية والفيزيائية يعوق التحليلات العالمية الموثوقة والقابلة للتكرار ، خاصة بالنسبة للمركبات الكهربائية الموجودة في خليط (عينة خام). لذلك ، هناك حاجة إلى طرق الكشف والتوصيف للمركبات الكهربائية ، بشكل فردي وعام لاستكمال الطرق الأخرى الأسرع ولكن غير الانتقائية6.
يسمح التصوير عالي الدقة بواسطة TEM (أو cryoTEM) أو AFM بتحديد مورفولوجيا ومقاييس المركبات الكهربائية بدقة نانومترية7،8،9،10،11،12. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لاستخدام المجهر الإلكتروني للأشياء البيولوجية ، مثل EVs ، هو الحاجة إلى فراغ لإجراء الدراسة التي تتطلب تثبيت وتجفيف العينة. مثل هذا التحضير يجعل من الصعب الترجمة من الهياكل التي تمت ملاحظتها إلى مورفولوجيا EV في الحل. لتجنب هذا الجفاف للعينة ، فإن تقنية cryoTEM هي الأنسب لتوصيف EV13. يستخدم على نطاق واسع لتحديد البنية التحتية للمركبات الكهربائية. كما أن وضع العلامات المناعية للحويصلات بواسطة جسيمات الذهب النانوية الوظيفية بيولوجيا يجعل من الممكن تحديد مجموعات فرعية محددة من المركبات الكهربائية وتمييزها عن الجسيمات الأخرى الموجودة في عينة بيولوجية معقدة. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض عدد المركبات الكهربائية التي تم تحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني ، غالبا ما يكون من الصعب إجراء توصيف يمثل عينة معقدة وغير متجانسة.
للكشف عن عدم تجانس الحجم هذا ، تقترح الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV) تحليل عدد كاف من الصور واسعة المجال ، مصحوبة بصور أصغر ، للكشف عن EVs فردية عالية الدقة14. AFM هو بديل للنهج البصرية وتقنيات الحيود الإلكترونية لدراسة المركبات الكهربائية. تستخدم هذه التقنية طرفا حادا يحمله ناتئ مرن يقوم بمسح العينة المودعة على دعامة واحدة ، سطرا بسطر ، ويضبط المسافة بين الطرف والعناصر الموجودة من خلال حلقة التغذية المرتدة. هذا يجعل من الممكن توصيف تضاريس العينة وجمع المعلومات المورفولوجيةالميكانيكية 15،16،17،18. يمكن مسح المركبات الكهربائية بواسطة AFM إما بعد ترسبها على ركيزة مسطحة ذريا أو بعد التقاطها على ركيزة معينة تعمل بواسطة الأجسام المضادة أو الببتيدات أو الأبتامرات لتوصيف المجموعات السكانية الفرعيةالمختلفة 18,19. نظرا لقدرته على تحديد البنية والميكانيكا الحيوية والمحتوى الجزيئي الحيوي الغشائي للمركبات الكهربائية داخل العينات البيولوجية المعقدة والتحقيق فيها في وقت واحد دون الحاجة إلى المعالجة المسبقة أو وضع العلامات أو الجفاف ، يتم الآن استخدام AFM بشكل متزايد لتوصيف المركبات الكهربائية بطريقة دقيقة ومتعددة المعلمات في ظل الظروف الفسيولوجية لدرجة الحرارة والمتوسطة.
تقترح هذه الورقة منهجية تستخدم رقاقة حيوية ذهبية أساسية قادرة على أن تكون وظيفية كيميائيا (حيوية) بتنسيق متعدد الإرسال. هذه الركيزة هي حجر الزاوية في منصة تحليلية قوية تجمع بين الكشف البيولوجي عن مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية عن طريق رنين البلازمون السطحي ، وبمجرد امتصاص / تطعيم المركبات الكهربائية أو التقاطها مناعيا على الرقاقة ، يتيح AFM التوصيف المترولوجي والمورفولوجي للمركبات الكهربائية. إلى جانب توقيع رامان للمجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية التي تم التقاطها على الشريحة ، تتيح هذه المنصة التحليلية تأهيل المركبات الكهربائية الموجودة في العينات البيولوجية بطريقة خالية من الملصقات ودون الحاجة إلى خطوات ما قبل التحليل. توضح هذه الورقة أن الجمع بين التقنيات القوية ، بمساعدة منهجية صارمة للغاية في إعداد الركيزة والحصول على البيانات ، يجعل تحليل EV عميقا ونهائيا وقويا.
مبدأ النهج المقترح هو إعداد ركيزة ذهبية ، لامتصاص / تطعيم أو التقاط الأنواع الفرعية للمركبات الكهربائية ، ومسحها ضوئيا بواسطة AFM لتقدير حجم وشكل كل مجموعة فرعية من المركبات الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحليل تلك المركبات الكهربائية الممتصة بواسطة التحليل الطيفي لرامان. يمكن لهذه الركيزة ، في الواقع ، أن تقدم ثلاثة أنواع من الواجهات ذات التعقيد المتزايد: المصفوفات الدقيقة العارية أو الوظيفية كيميائيا أو الرباط. قبل وصف الخطوات المختلفة للبروتوكول ، تتم إحالة القراء إلى العرض التخطيطي لنهج منصة التحليل الحيوي النانوي (NBA) في الشكل 1 ، والذي يجمع بين التصوير بالرنين البلازموني السطحي (SPRi) و AFM والتحليل الطيفي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> الشكل 1: منصة التحليل الحيوي النانوي. يجمع هذا النهج بين (أ) التصوير بالرنين البلازموني السطحي ، (ب) مجهر القوة الذرية ، والتحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء / رامان (نانو) ، وكلها تعمل على نفس الركيزة - شريحة ذهبية متعددة. الاختصارات: NBA = منصة التحليل الحيوي النانوي ؛ SPRi = التصوير بالرنين البلازموني السطحي ؛ AFM = مجهر القوة الذرية ؛ EV = حويصلة خارج الخلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تشكل الرقاقة الحيوية الذهبية الأساسية قلب المنصة حيث يتم إجراء جميع تقنيات التوصيف الخالية من الملصقات على هذه الرقاقة الحيوية. وفقا لاحتياجات توصيف EV (إما مجموعات EVs العالمية / الكلية أو مجموعات فرعية EV) وقيود / متطلبات الطرق المستخدمة ، تم تطوير ثلاثة أنواع من أسطح الرقائق الحيوية الذهبية: إما "عارية" ، وظيفية كيميائيا "C11 / C16" ، أو ligand-biofunctionalized ، تسمى سطح الذهب "ligand".
تتيح الرقاقة الحيوية العارية ، المسماة "عارية" ، الامتزاز البسيط للمركبات الكهربائية على الذهب. من الممكن تحديد المخزن المؤقت المستخدم وتحقيق هذا الامتزاز إما بطريقة سلبية (الحضانة ثم خطوات الشطف) أو لمراقبته تحت التدفق (في SPRi). علاوة على ذلك ، يمكن تحقيق هذا الامتزاز السلبي إما على الشريحة بأكملها (كمصفوفة كبيرة) أو موضعية في المصفوفات الدقيقة باستخدام مراقب ماصة دقيقة. يسمح "إجراء التدفق المنخفض" للمحققين بمتابعة الحركية ومستوى امتصاص EV. يتم اعتماد هذا النهج على الركيزة الذهبية المجردة عندما تتداخل واجهة الطبقة الكيميائية مع الطريقة التحليلية (على سبيل المثال ، لتحليل رامان الطيفي).
تستخدم الرقاقة الحيوية الوظيفية كيميائيا ، والتي تسمى "C11 / C16" ، لإنشاء "سجادة" كثيفة وقوية من المركبات الكهربائية المرتبطة تساهميا على سطح الذهب عن طريق تكوين روابط أميد أولية مع الثيولات عندما يكون الهدف هو الحصول على رؤية عالمية لعينة EV. في الواقع ، في هذه الحالة ، يتم تشغيل الذهب بواسطة خليط ثيولات من mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") وحمض mercapto-1-hexadecanoic (16-MHA: "C16") ، ويتم تنشيط جزء من الثيولات كيميائيا لإنشاء ارتباط تساهمي مع الأهداف. مرة أخرى ، يمكن تحقيق هذه الاستراتيجية إما بشكل سلبي (خطوات الحضانة ثم الشطف ، إما في "macroarray" أو في مصفوفات دقيقة متعددة باستخدام مراقب micropipit) أو تحت معدلات التدفق (في SPRi) لمتابعة حركية ومستوى تطعيم EV على سطح الذهب.
يتم تنشيط الرقاقة الحيوية ذات الوظائف الحيوية ، والتي تسمى "الروابط" ، كيميائيا لتطعيم روابط مختلفة تساهميا (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة والمستقبلات) لالتقاط مجموعات فرعية مختلفة من EV تتعايش في العينة البيولوجية بشكل انتقائي (مع التقارب).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD41a antibody</td>
			<td>Diaclone SAS (France)</td>
			<td>447528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP920</td>
			<td>Microparticles GmbH, Germany</td>
			<td>448303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXR3xi&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs derived from platelet concentrates</td>
			<td>Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs from bovine milk</td>
			<td>Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion&#160;</td>
			<td></td>
			<td>853.223.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetron sputtering</td>
			<td>PLASSYS</td>
			<td>SAB5300165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercapto-1-hexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercapto-1-undecanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountains SPIP ones</td>
			<td>Digital Surf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWizard 3 Bioscience&#160;</td>
			<td>Bruker-JPK&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside (OG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumine antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Albumin Serum (RSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-Biacore 3000</td>
			<td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Biochip</td>
			<td>MIMENTO technology platform</td>
			<td></td>
			<td>The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Plex II</td>
			<td>Horiba Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي حويصلات صغيرة مشتقة من الغشاء تنتجها جميع الخلايا التي يتراوح قطرها من 50 إلى عدة مئات من النانومتر وتستخدم كوسيلة للاتصال بين الخلايا. وهي تبرز كأدوات تشخيصية وعلاجية واعدة لمجموعة متنوعة من الأمراض. هناك نوعان من عمليات التكون الحيوي الرئيسية التي تستخدمها الخلايا لإنتاج EVs مع اختلافات في الحجم والتكوين والمحتوى. نظرا لتعقيدها العالي في الحجم والتكوين وأصل الخلية ، يتطلب توصيفها مزيجا من التقنيات التحليلية. يتضمن هذا المشروع تطوير جيل جديد من المنصات التحليلية متعددة المعلمات مع زيادة الإنتاجية لتوصيف المجموعات السكانية الفرعية للمركبات الكهربائية. لتحقيق هذا الهدف ، يبدأ العمل من منصة التحليل الحيوي النانوي (NBA) التي أنشأتها المجموعة ، والتي تسمح بإجراء تحقيق أصلي للمركبات الكهربائية بناء على مزيج من طرق الاستشعار الحيوي متعددة الإرسال مع التحليلات المترولوجية والمورفولوجية بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM) للأهداف الحويصلية المحاصرة على رقاقة حيوية ميكروأري. كان الهدف هو إكمال هذا التحقيق في EV بتحليل النمط الظاهري والجزيئي بواسطة مطيافية رامان. تمكن هذه التطورات من اقتراح حل تحليلي متعدد الوسائط وسهل الاستخدام للتمييز بين المجموعات الفرعية EV في السوائل البيولوجية ذات الإمكانات السريرية

تحديد ظروف الأس الهيدروجيني المثلى لتطعيم الليجند يتم اختبار الروابط المختلفة المستخدمة لإعداد الرقائق الحيوية كدالة للأس الهيدروجيني وتوافرها للتفاعل مع الطبقة الكيميائية الثيولات (الشكل 3). يتم تخفيف الروابط في محلول الأسيتات عند قيم أس هيدروجيني مختلفة وي?...

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

تقترح هذه الورقة جيلا جديدا من المنصات التحليلية متعددة المعلمات مع زيادة الإنتاجية لتوصيف مجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية. تعتمد الطريقة على مزيج من طرق الاستشعار الحيوي متعددة الإرسال مع التحليلات المترولوجية والمورفولوجية بواسطة مجهر القوة الذرية ، إلى جانب التحليل الطيفي رامان ، لتأهيل الأهداف الحويصلية المحاصرة على رقاقة حيوية ميكروأري.

منصة تحليلية متعددة الوسائط على رقاقة تصوير رنين البلازمون السطحية متعددة الإرسال لتحليل مجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

تجعل الطبيعة المعقدة للمركبات الكهربائية من الصعب التعرف على السكان الفرعيين محل الاهتمام ، ويمكن لهذا البروتوكول اكتشافها من خلال نمطها الظاهري وملف تعريف الحجم والخصائص الميكانيكية النانوية. هذا المزيج من التقنية هو طريقة خالية من الملصقات ، والتي تسمح لنا باكتشاف المركبات الكهربائية في الوقت الفعلي من وسائط الحالة وبلازما الدم. تمكن هذه التقنية من توصيف مجموعة فرعية عميقة من الجسيمات النانوية ذات الأهمية ، من أجل استخدامها كمؤشرات حيوية لعلم الأمراض ، أو تستخدم أيضا كجسيمات نانوية لتوصيل الدواء.نظرا لأنها طريقة حساسة للغاية ، فمن الضروري الانتباه إلى إعداد الرقائق الحيوية قبل حقن عينتك التي تهمك. بعد طلاء الرقائق وتشغيلها ، احتضان الرقاقة الحيوية في خليط من 200 مليمولار إيثيل ثنائي ميثيل أمينوبروبيل كربوديميد / N-hydroxysuccinimide و 50 مليمولار لكل لتر N-hydroxysuccinimide لمدة 30 دقيقة على الأقل في الظلام في درجة حرارة الغرفة. باستخدام المراقب ، أضف 300 نانولتر من محلول ليجند واحتضان الرقاقة الحيوية تحت حمام صوتي لمدة 30 دقيقة.اغسل الرقاقة الحيوية من الأعلى بماء عالي النقاء. أضف قطرة من الزيت بنفس معامل الانكسار مثل المنشور لإنشاء طبقة رقيقة موحدة بين الرقاقة الحيوية والمنشور ، وضعها برفق على منشور بنفس معامل الانكسار مثل الرقاقة الحيوية. لتصوير رنين البلازمون السطحي ، قم بتركيب الرقاقة الحيوية على نظام SPRi.انتقل إلى القائمة المنسدلة على الجانب الأيسر من البرنامج ، وانقر فوق دليل العمل. ابحث عن الصورة التي تظهر فيها نقاط مختلفة ، وانقر لتحديد هذه الصورة. ثم اكتب اسم عائلات ligand ، وانقر على تعريف الأنواع Finish.اسحب الخط الأسود مع المؤشر إلى زاوية العمل المثلى. انقر فوق تحريك المرآة إلى زاوية العمل ، وحدد زاوية العمل. انقر الآن على الحركية.نظرا لأن البرنامج يطالب المستخدم بتحديد عنصر التحكم السلبي ، فاختر لا يوجد تحكم سلبي في هذه المرحلة. حقن ألبومين مصل الفئران بمعدل 50 ميكرولتر في الدقيقة لمدة أربع دقائق. حقن الإيثانولامين بمعدل 20 ميكرولترا في الدقيقة لمدة 10 دقائق لإلغاء تنشيط المجموعات الكربوكسيلية التي لا تزال موجودة ومتفاعلة على السطح.بعد ذلك ، اغسل الرقاقة الحيوية عن طريق حقن 40 مليمول OG بمعدل 50 ميكرولتر في الدقيقة لمدة أربع دقائق. حقن الحويصلات خارج الخلية بتركيز محدد على الرقاقة الوظيفية الحيوية مع اتباع حركية تفاعل الحويصلات على البقع المختلفة ، في وقت واحد. حدد أيضا قيمة الانعكاس ومستوى التفاعل.بمجرد الاستقرار ، قم بحقن الجلوتارالدهيد على الشريحة لإصلاح الحويصلات خارج الخلية في مكانها قبل إجراء تصوير AFM. قم بمحاذاة الرقاقة الحيوية أعلى القناع على الشريحة الزجاجية. استخدم كاميرا CCD أعلى AFM لتحديد موقع الكابولي في المكان الصحيح الذي يجب مسحه ضوئيا.ابدأ اكتساب AFM في وضع الاتصال من ثلاث إلى خمس مناطق كبيرة إلى صغيرة. بعد ذلك ، تعامل مع صور AFM باستخدام برنامج معالجة بيانات JPK عن طريق تحديد قناة الارتفاع أولا. اختر ملاءمة كثيرة الحدود ليتم طرحها من كل سطر للحصول على خطوط مسح مستقيمة.حدد عتبة الارتفاع على حبيبات الذهب للتخلص من الخشونة على السطح. تحدد وحدة استخراج الحبوب الحبوب باستخدام عتبة ارتفاع تبلغ 8.5 نانومتر. تم تحليل الرقائق الحيوية المتعددة بعد تخميل الألبومين.الشريحة بدون افتراضي. الرقاقة مع بعض العيوب ، بسبب انصهار البقع ، أو ضعف التطعيم ، أو الفقاعات أو الملوثات. وتظهر شريحة ذهبية عارية بدون مصفوفات دقيقة لفحص امتزاز الحويصلات خارج الخلية على الذهب.أظهرت تجربة الالتقاط على رقاقة حيوية متعددة الإرسال إشارات انعكاسية جيدة للروابط المختلفة ، ونسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة للروابط المختلفة ، لأن استجابة التحكم السلبي كانت ضئيلة. أظهر امتزاز الحويصلة خارج الخلية بعد حقن عينة الحويصلة خارج الخلية إشارة انعكاسية عالية ، مما يشير إلى أن تلك الحويصلات كانت قادرة على الامتصاص والبقاء مستقرة على رقاقة الذهب. بعد تحميل الحويصلة خارج الخلية ، تم إنشاء صور AFM واسعة النطاق وصغيرة الحجم للحويصلات خارج الخلية على الرقائق الحيوية.تتيح الرؤية الأقرب عالية الدقة قياس الحويصلات خارج الخلية. تراوح القطر الفعال للحويصلات خارج الخلية على رقاقة حيوية من 30 إلى 300 نانومتر ، مع أغلبية كبيرة حوالي 60 نانومتر. كانت النتائج التي تم الحصول عليها في الهواء والسائل قابلة للمقارنة.كشف طيف رامان من الحويصلات خارج الخلية الممتصة على شريحة عارية عن طيف واضح ، مع قمم تتوافق بشكل أساسي مع اهتزازات الميثيلين ، والتي ترتبط بدهون أغشية الحويصلة خارج الخلية. من المهم تحضير رقاقة حيوية بدقة حتى تتمكن من اكتشاف المركبات الكهربائية الخاصة بك بدقة وبطريقة قابلة للتكرار. يمكن استخدام الطرق التقليدية مثل النشاف الغربي وتحليل تتبع الجسيمات النانوية لربط وتأكيد الأنماط الظاهرية وأنماط الحجم.علاوة على ذلك ، من المتصور أن تتعمق التحليلات متعددة الأوميك في التوصيف الجزيئي للمركبات الكهربائية والتمييز المحتمل بين المجموعات الفرعية.

Research

JoVE Journal

Biology

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Lensless على رقاقة التصوير من الخلايا يوفر أداة جديدة للإنتاجية عالية الأحياء الخلوي والتشخيص الطبي

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA التخصيب من قبل القائم على تقنية Transposase لتحليل NGS من تسلسل كامل ل<em&gt; BRCA1</em&gt;،<em&gt; BRCA2</em&gt;، و 9 الجينات المسؤولة عن إصلاح الحمض النووي الأضرار

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...