Name: multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Kelly Aubertin und Fabien Picot von der IVETh Core Facility (Paris) werden für die Raman-Bildgebungsexperimente ausgezeichnet. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) und Zuzana Krupova (aus Helincourt, Frankreich) werden für die Bereitstellung der EV-Proben aus Blutplättchen- bzw. Rindermilchproben ausgezeichnet. Die Arbeit wurde von der Region Bourgogne Franche-Comté und der Graduiertenschule EUR EIPHI (NOVICE-Projekt, 2021-2024) unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde mit der CLIPP-Plattform und in RENATECH-Reinraumanlagen in FEMTO-ENGINEERING durchgeführt, wofür wir Rabah Zeggari danken.

1. Vorbereitung des Goldsubstrats
HINWEIS: Drei Arten von Oberflächen werden auf Goldchips hergestellt: 1) nackte Oberfläche, 2) chemisch funktionalisiert und 3) biofunktionalisiert (Liganden, die auf die C11C16-Schicht gepfropft sind). Sie werden ab diesem Zeitpunkt als "nackt", "C11C16" bzw. "Liganden" bezeichnet.
<ol><li>Vorbereitung des Goldsubstrats: HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden die Gold-Biochips im eigene...

<ol>
	<li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products:+A+position+paper+of+the+group+&amp;#34;Extracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France&amp;#34;.">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &amp;#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&amp;#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).</li><li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes.">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li><li>Hartjes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+vesicles+as+emerging+theranostic+nanoplatforms.">Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms.</a> Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).</li><li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations.">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).</li><li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Definition,+isolation+and+characterization.">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li><li>Brisson, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo.">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion:+A+tool+to+improve+transfusion+safety.">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+&#171;on-chip&#187;+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles.">Development of a NanoBioAnalytical platform for &#171;on-chip&#187; 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J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing.">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li><li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging.">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246 (2016).</li><li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles.">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li></ol>

Die neueren Methoden zur Identifizierung von EVs, die am weitesten verbreitet sind, sind proteinspezifisches Immunblotting, um die Herkunft von EVs zu bestätigen, TEM, um ihre Struktur zu bestätigen, und NTA, um ihre Anzahl und Größenverteilung in einem Probenvolumen3 zu quantifizieren. Nichtsdestotrotz haben das große Interesse an Elektrofahrzeugen in der (bio-)medizinischen Forschung und die Einschränkungen bestehender Analysewerkzeuge die wissenschaftliche Gemeinschaft dazu veranlasst, ne...

Das wachsende Interesse an der EV-Forschung in der Diagnose und in der Therapie 1,2,3,4,5, kombiniert mit den Herausforderungen, mit denen dieses Feld konfrontiert ist, hat zur Entwicklung und Implementierung einer Vielzahl von Ansätzen und Techniken zur Quantifizierung oder Charakterisierung dieser Vesikel geführt. Die am weitesten verbreiteten Methoden zur Identifizierung von EVs sind proteinspezifisches Immunblotting und Proteomik, um die Herkunft von EVs zu bestätigen, Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), um ihre Struktur zu bestätigen, und Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), um ihre Anzahl und Größenverteilung in einem Probenvolumen zu quantifizieren.
Keine dieser Techniken allein liefert jedoch alle Informationen, die zur Charakterisierung von EV-Untergruppen erforderlich sind. Die inhärente Heterogenität von Elektrofahrzeugen aufgrund der Vielfalt ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften erschwert globale Analysen, die zuverlässig und reproduzierbar sind, insbesondere für Elektrofahrzeuge, die in einem Gemisch (Rohprobe) enthalten sind. Detektions- und Charakterisierungsmethoden sind daher für Elektrofahrzeuge sowohl einzeln als auch allgemein erforderlich, um andere Methoden zu ergänzen, die schneller, aber nicht selektiv sind6.
Die hochauflösende Bildgebung mittels TEM (oder KryoTEM) oder AFM ermöglicht die Bestimmung der Morphologie und Metrologie von EVs mit einer nanometrischen Auflösungvon 7,8,9,10,11,12. Die Haupteinschränkung bei der Verwendung der Elektronenmikroskopie für biologische Objekte, wie z. B. Elektrofahrzeuge, ist jedoch die Notwendigkeit eines Vakuums zur Durchführung der Studie, die die Fixierung und Dehydratisierung der Probe erfordert. Eine solche Präparation macht es schwierig, von den beobachteten Strukturen auf die EV-Morphologie in Lösung zu übertragen. Um diese Dehydratisierung der Probe zu vermeiden, ist die Technik der KryoTEM für die EV-Charakterisierung am besten geeignet13. Es wird häufig zur Bestimmung der Ultrastruktur von Elektrofahrzeugen verwendet. Die Immunmarkierung von Vesikeln durch biofunktionalisierte Goldnanopartikel ermöglicht es auch, spezifische Subpopulationen von EVs zu identifizieren und sie von anderen Partikeln zu unterscheiden, die in einer komplexen biologischen Probe vorhanden sind. Aufgrund der geringen Anzahl von EVs, die durch Elektronenmikroskopie analysiert werden, ist es jedoch oft schwierig, eine Charakterisierung durchzuführen, die für eine komplexe und heterogene Probe repräsentativ ist.
Um diese Größenheterogenität aufzudecken, schlägt die International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) vor, eine ausreichende Anzahl von Weitfeldbildern zu analysieren, begleitet von kleineren Bildern, um einzelne EVs mit hoher Auflösung zu enthüllen14. AFM ist eine Alternative zu optischen Ansätzen und elektronischen Beugungstechniken für die Untersuchung von Elektrofahrzeugen. Bei dieser Technik wird eine scharfe Spitze verwendet, die von einem flexiblen Ausleger gehalten wird, der die auf einem Träger abgelagerte Probe Zeile für Zeile abtastet und den Abstand zwischen der Spitze und den vorhandenen Elementen durch eine Rückkopplungsschleife anpasst. Dies ermöglicht es, die Topographie der Probe zu charakterisieren und morphomechanische Informationen zu sammeln15,16,17,18. Die EVs können mittels AFM gescannt werden, nachdem sie entweder auf einem atomar flachen Substrat abgeschieden wurden oder nachdem sie auf einem spezifischen Substrat eingefangen wurden, das durch Antikörper, Peptide oder Aptamere funktionalisiert wurde, um die verschiedenen Subpopulationen zu charakterisieren18,19. Aufgrund seiner Fähigkeit, die Struktur, die Biomechanik und den membranösen biomolekularen Gehalt von EVs in komplexen biologischen Proben zu quantifizieren und gleichzeitig zu untersuchen, ohne dass eine Vorbehandlung, Markierung oder Dehydratisierung erforderlich ist, wird AFM nun zunehmend zur feinen und multiparametrischen Charakterisierung von EVs unter physiologischen Bedingungen von Temperatur und Medium eingesetzt.
In diesem Artikel wird eine Methodik vorgeschlagen, bei der ein Kern-Gold-Biochip verwendet wird, der in einem Multiplex-Format (bio)chemisch funktionalisiert werden kann. Dieses Substrat ist der Eckpfeiler einer leistungsstarken analytischen Plattform, die die biologische Detektion von EV-Untergruppen durch Oberflächenplasmonenresonanz kombiniert, und sobald die EVs auf dem Chip adsorbiert/gepfropft oder immuneingefangen sind, ermöglicht AFM die metrologische und morphomechanische Charakterisierung der EVs. In Verbindung mit der Raman-Signatur der auf dem Chip erfassten EV-Untergruppen ermöglicht diese Analyseplattform die Qualifizierung der in biologischen Proben vorhandenen EVs markierungsfrei und ohne präanalytische Schritte. Dieses Papier zeigt, dass die Kombination aus leistungsstarken Techniken, unterstützt durch eine sehr strenge Methodik bei der Substratvorbereitung und Datenerfassung, die EV-Analyse tiefgreifend, definitiv und robust macht.
Das Prinzip des vorgeschlagenen Ansatzes besteht darin, ein Goldsubstrat herzustellen, die EV-Subtypen zu adsorbieren/pfropfen oder einzufangen und sie mit AFM zu scannen, um die Größe und Morphologie jeder EV-Untergruppe abzuschätzen. Zusätzlich werden diese adsorbierten EVs mittels Raman-Spektroskopie analysiert. Dieses Substrat kann in der Tat drei Arten von Grenzflächen mit wachsender Komplexität aufweisen: nackte, chemisch funktionalisierte oder Liganden-Microarrays. Bevor die verschiedenen Schritte des Protokolls beschrieben werden, wird auf die schematische Darstellung des Ansatzes der nanobioanalytischen Plattform (NBA) in Abbildung 1 verwiesen, der Oberflächenplasmonenresonanztomographie (SPRi), AFM und Spektroskopie kombiniert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Die NanoBioAnalytical Plattform. Der Ansatz kombiniert (A) Oberflächenplasmonenresonanztomographie, (B) Rasterkraftmikroskopie und Infrarot/Raman-(Nano-)Spektroskopie, die alle auf demselben Substrat - einem Multiplex-Goldchip - eingesetzt werden. Abkürzungen: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie; AFM = Rasterkraftmikroskopie; EV = extrazelluläres Vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Der Kern-Gold-Biochip bildet das Herzstück der Plattform, da alle markierungsfreien Charakterisierungstechniken auf diesem Biochip durchgeführt werden. Entsprechend den Anforderungen der EV-Charakterisierung (entweder globale/totale EVs oder EV-Untergruppen) und den Einschränkungen/Anforderungen der verwendeten Methoden wurden drei Arten von Gold-Biochip-Oberflächen entwickelt: entweder "nackte", chemisch funktionalisierte "C11/C16" oder ligandenbiofunktionalisierte, als "Liganden"-Goldoberfläche bezeichnete Goldoberfläche.
Der nackte Biochip, "nackt" genannt, ermöglicht die einfache Adsorption von Elektrofahrzeugen auf Gold. Es ist möglich, den verwendeten Puffer auszuwählen und diese Adsorption entweder passiv (Inkubations- und Spülschritte) oder unter Durchfluss (in SPRi) zu überwachen. Darüber hinaus kann diese passive Adsorption entweder auf dem gesamten Chip (als Makroarray) oder in Microarrays mit einem Mikropipetten-Spotter lokalisiert werden. Das "Under Flow-Verfahren" ermöglicht es den Ermittlern, die Kinetik und das Ausmaß der EV-Adsorption zu verfolgen. Dieser Ansatz auf dem nackten Goldsubstrat wird angewendet, wenn die chemische Schichtgrenzfläche die analytische Methode stören kann (z. B. für die Raman-Spektroskopie).
Der chemisch funktionalisierte Biochip mit der Bezeichnung "C11/C16" wird verwendet, um einen dichten und robusten "Teppich" aus EVs zu erzeugen, die kovalent an der Goldoberfläche gebunden sind, indem primäre Amidbindungen mit den Thiolaten gebildet werden, wenn das Ziel darin besteht, eine globale Sicht auf die EV-Probe zu erhalten. Tatsächlich wird das Gold in diesem Fall durch eine Thiolatmischung aus Mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") und Mercapto-1-hexadecansäure (16-MHA: "C16") funktionalisiert, und ein Teil der Thiolate wird chemisch aktiviert, um eine kovalente Bindung an die Ziele herzustellen. Auch diese Strategie kann entweder passiv (Inkubations- und anschließende Spülschritte, entweder in "Makroarrays" oder in mehreren Mikroarrays mit einem Mikropipetten-Spotter) oder unter Durchflussraten (in SPRi) realisiert werden, um die Kinetik und den Grad der EV-Pfropfung auf der Goldoberfläche zu verfolgen.
Der liganden-biofunktionalisierte Biochip, der als "Liganden" bezeichnet wird, wird chemisch aktiviert, um verschiedene Liganden (z. B. Antikörper, Rezeptoren) kovalent zu transplantieren, um selektiv (mit Affinität) verschiedene EV-Untergruppen zu erfassen, die in der biologischen Probe koexistieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD41a antibody</td>
			<td>Diaclone SAS (France)</td>
			<td>447528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP920</td>
			<td>Microparticles GmbH, Germany</td>
			<td>448303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXR3xi&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs derived from platelet concentrates</td>
			<td>Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs from bovine milk</td>
			<td>Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion&#160;</td>
			<td></td>
			<td>853.223.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetron sputtering</td>
			<td>PLASSYS</td>
			<td>SAB5300165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercapto-1-hexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercapto-1-undecanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountains SPIP ones</td>
			<td>Digital Surf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWizard 3 Bioscience&#160;</td>
			<td>Bruker-JPK&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside (OG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumine antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Albumin Serum (RSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-Biacore 3000</td>
			<td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Biochip</td>
			<td>MIMENTO technology platform</td>
			<td></td>
			<td>The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Plex II</td>
			<td>Horiba Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranabgeleitete, winzige Vesikel, die von allen Zellen mit einem Durchmesser von 50 bis mehreren hundert Nanometern produziert werden und als Mittel zur interzellulären Kommunikation verwendet werden. Sie entwickeln sich zu vielversprechenden diagnostischen und therapeutischen Instrumenten für eine Vielzahl von Krankheiten. Es gibt zwei Hauptbiogeneseprozesse, die von Zellen verwendet werden, um EVs mit Unterschieden in Größe, Zusammensetzung und Inhalt herzustellen. Aufgrund ihrer hohen Komplexität in Größe, Zusammensetzung und Zellherkunft erfordert ihre Charakterisierung eine Kombination von Analysetechniken. Dieses Projekt beinhaltet die Entwicklung einer neuen Generation von multiparametrischen Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von Subpopulationen von Elektrofahrzeugen. Um dieses Ziel zu erreichen, geht die Arbeit von der von der Gruppe etablierten nanobioanalytischen Plattform (NBA) aus, die eine originelle Untersuchung von EVs auf der Grundlage einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) von vesikulären Targets ermöglicht, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind. Ziel war es, diese EV-Untersuchung mit einer phänotypischen und molekularen Analyse mittels Raman-Spektroskopie abzuschließen. Diese Entwicklungen ermöglichen den Vorschlag einer multimodalen und einfach zu bedienenden analytischen Lösung für die Unterscheidung von EV-Untergruppen in biologischen Flüssigkeiten mit klinischem Potenzial

Bestimmung der optimalen pH-Bedingungen für die Ligandentransplantation Die verschiedenen Liganden, die zur Herstellung der Biochips verwendet werden, werden in Abhängigkeit vom pH-Wert und ihrer Verfügbarkeit für die Interaktion mit der chemischen Thiolatschicht getestet (Abbildung 3). Die Liganden werden in Acetatpuffer bei unterschiedlichen pH-Werten verdünnt und auf den mit einer C11C16-Schicht chemisch funktionalisierten Biochip injiziert. Die Lösungen werden n...

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Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

In diesem Artikel wird eine neue Generation multiparametrischer Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von extrazellulären Vesikel-Untergruppen vorgeschlagen. Die Methode basiert auf einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie, gekoppelt mit Raman-Spektroskopie, um vesikuläre Ziele zu qualifizieren, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind.

Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Die Komplexität von Elektrofahrzeugen macht es schwierig, die interessierende Subpopulation zu erkennen, und dieses Protokoll kann sie anhand ihres Phänotyps, ihres Größenprofils und ihrer nanomechanischen Eigenschaften erkennen. Diese Kombination von Techniken ist eine markierungsfreie Methode, die es uns ermöglicht, EVs in Echtzeit aus den Zustandsmedien und dem Blutplasma zu erkennen. Diese Technik ermöglicht es, eine tiefe Untergruppe von Nanopartikeln von Interesse zu charakterisieren, um als Bioindikatoren der Pathologie oder auch als Nanopartikel für die Arzneimittelabgabe verwendet zu werden.Da es sich um eine sehr empfindliche Methode handelt, ist es unbedingt erforderlich, auf die Biochip-Vorbereitung zu achten, bevor Sie Ihre interessierende Probe injizieren. Nach dem Beschichten und Funktionalisieren der Chips wird der Biochip in einer Mischung aus 200-millimolaren Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid und 50 Millimolar pro Liter N-Hydroxysuccinimid für mindestens 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Fügen Sie mit dem Spotter 300 Nanoliter Ligandenlösung hinzu und inkubieren Sie den Biochip 30 Minuten lang unter einem Schallbad.Waschen Sie den Biochip von oben mit Reinstwasser. Fügen Sie ein Tröpfchen Öl mit dem gleichen Brechungsindex wie das Prisma hinzu, um eine gleichmäßige dünne Schicht zwischen dem Biochip und dem Prisma zu erzeugen, und legen Sie es vorsichtig auf ein Prisma mit dem gleichen Brechungsindex wie der Biochip. Für die Oberflächenplasmonenresonanztomographie montieren Sie den Biochip auf dem SPRi-System.Navigieren Sie zum Dropdown-Menü auf der linken Seite der Software und klicken Sie auf das Arbeitsverzeichnis. Suchen Sie das Bild, auf dem verschiedene Stellen sichtbar sind, und klicken Sie, um dieses Bild auszuwählen. Schreiben Sie dann den Namen der Ligandenfamilien und klicken Sie auf die Definition der finnischen Spezies.Ziehen Sie die schwarze Linie mit dem Cursor in den optimalen Arbeitswinkel. Klicken Sie auf Spiegel in Arbeitswinkel verschieben und wählen Sie einen Arbeitswinkel aus. Klicken Sie nun auf Kinetik.Wenn die Software den Benutzer auffordert, die Negativkontrolle zu definieren, wählen Sie an dieser Stelle Keine Negativkontrolle aus. Injizieren Sie vier Minuten lang Rattenserumalbumin in einer Menge von 50 Mikrolitern pro Minute. Injizieren Sie Ethanolamin mit 20 Mikrolitern pro Minute für 10 Minuten, um die noch vorhandenen und reaktiven Carboxylgruppen auf der Oberfläche zu deaktivieren.Waschen Sie anschließend den Biochip, indem Sie vier Minuten lang 40 millimolare OG mit 50 Mikrolitern pro Minute injizieren. Injizieren Sie die extrazellulären Vesikel in einer bestimmten Konzentration auf den biofunktionalisierten Chip, während Sie gleichzeitig die Kinetik der Wechselwirkung der Vesikel an den verschiedenen Stellen verfolgen. Bestimmen Sie auch den Wert des Reflexionsvermögens und den Grad der Wechselwirkung.Nach der Stabilisierung injizieren Sie Glutaraldehyd auf den Chip, um extrazelluläre Vesikel an der Stelle zu fixieren, an der sie sich befinden, bevor Sie eine AFM-Bildgebung durchführen. Richten Sie den Biochip auf der Oberseite der Maske auf dem Objektträger aus. Verwenden Sie die CCD-Kamera oben auf dem AFM, um den Ausleger an der richtigen Stelle zu lokalisieren, die gescannt werden muss.Starten Sie die AFM-Erfassung im Kontaktmodus von drei bis fünf großen bis kleinen Bereichen. Behandeln Sie als Nächstes die AFM-Bilder mit der JPK-Datenverarbeitungssoftware, indem Sie zuerst den Höhenkanal auswählen. Wählen Sie eine Polynomanpassung, die von jeder Linie subtrahiert werden soll, um begradigte Scanlinien zu erhalten.Wählen Sie die Höhenschwelle für Goldkörner, um die Rauheit auf der Oberfläche zu beseitigen. Das Getreideextraktionsmodul markiert die Körner mit einer Höhenschwelle von 8,5 Nanometern. Multiplex-Biochips wurden nach Albuminpassivierung analysiert.Der Chip ohne Standard. Der Chip weist einige Defekte auf, die auf die Verschmelzung von Flecken, eine schwache Pfropfung oder Blasen oder Verunreinigungen zurückzuführen sind. Und gezeigt wird ein nackter Goldchip ohne Microarrays zur Untersuchung der Adsorption von extrazellulären Vesikeln auf Gold.Das Capture-Experiment auf einem gemultiplexten Biochip zeigte gute Reflektivitätssignale für verschiedene Liganden und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis für die verschiedenen Liganden, da die Reaktion der Negativkontrolle vernachlässigbar war. Die extrazelluläre Vesikeladsorption nach der Injektion der extrazellulären Vesikelprobe zeigte ein hohes Reflektivitätssignal, was darauf hindeutet, dass diese Vesikel in der Lage waren, zu adsorbieren und auf dem Goldchip stabil zu bleiben. Nach extrazellulärer Vesikelbeladung wurden die großskaligen und kleinskaligen AFM-Bilder von extrazellulären Vesikeln auf Biochips erzeugt.Eine hochauflösende Nahaufnahme ermöglicht die Metrologie extrazellulärer Vesikel. Der effektive Durchmesser der extrazellulären Vesikel auf einem Biochip lag zwischen 30 und 300 Nanometern, wobei die große Mehrheit bei etwa 60 Nanometern lag. Die in Luft und Flüssigkeit erzielten Ergebnisse waren vergleichbar.Das Raman-Spektrum extrazellulärer Vesikel, die auf einem nackten Chip adsorbiert wurden, zeigte ein klares Spektrum mit Peaks, die hauptsächlich Methylenschwingungen entsprechen, die mit den Lipiden extrazellulärer Vesikelmembranen assoziiert sind. Es ist wichtig, Ihren Biochip gründlich vorzubereiten, um Ihre Elektrofahrzeuge genau und reproduzierbar erkennen zu können. Konventionelle Methoden wie Western Blot und Nanopartikel-Tracking-Analyse können eingesetzt werden, um Phänotypen und Größenmuster zu korrelieren und zu bestätigen.Darüber hinaus sind Multi-Omik-Analysen vorgesehen, um noch tiefer in die molekulare Charakterisierung von EV und die mögliche Unterscheidung von Untergruppen einzudringen.

Research

JoVE Journal

Biology

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Forschung

Biologie

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Ohne Linsen auskommt, On-Chip-Bildgebung von Zellen hat ein neues Instrument für High-Throughput-Zell-Biologie und der medizinischen Diagnostik

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidität-basierte extrazelluläre Wechselwirkung Screening (AVEXIS) für die Erkennung von Scalable Low-Affinität extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...