Name: multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

קלי אוברטין ופביאן פיקו ממתקן הליבה IVETh (פריז) מוכרים על ניסויי ההדמיה של ראמאן. תיירי בורנוף (האוניברסיטה הרפואית של טאיפיי, טייוואן) וזוזנה קרופובה (מהלינקור, צרפת) מוכרים על מתן דגימות EV שמקורן בדגימות טסיות דם וחלב בקר, בהתאמה. העבודה נתמכה על ידי אזור Bourgogne Franche-Comté ובית הספר לתארים מתקדמים EUR EIPHI (פרויקט טירון, 2021-2024). חלק מעבודה זו נעשתה באמצעות פלטפורמת CLIPP ובמתקני החדרים הנקיים של RENATECH ב-FEMTO-ENGINEERING, ועל כך אנו מודים לרבאח זגרי.

1. הכנת מצע זהב
הערה: שלושה סוגים של משטחים מיוצרים על שבבי זהב: 1) משטח עירום, 2) מתפקד כימית, 3) ביו-פונקציונלי (ליגנדות שהושתלו על שכבת C11C16). מנקודה זו ואילך הם ייקראו "עירומים", "C11C16" ו"ליגנדים", בהתאמה.
<ol><li>הכנת מצע זהב: הערה: עבור פרוטוקול ?...

<ol>
	<li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products:+A+position+paper+of+the+group+&amp;#34;Extracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France&amp;#34;.">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &amp;#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&amp;#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).</li><li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes.">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li><li>Hartjes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+vesicles+as+emerging+theranostic+nanoplatforms.">Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms.</a> Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).</li><li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations.">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).</li><li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Definition,+isolation+and+characterization.">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li><li>Brisson, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+activated+platelets:+A+semiquantitative+cryo-electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+study.">Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study.</a> Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+A+novel+approach+to+the+detection+of+nanosized+blood+microparticles.">Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).</li><li>Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., P&#233;try, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensional+characterization+of+extracellular+vesicles+using+atomic+force+microscopy.">Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy.</a> Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).</li><li>Beekman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-capture+of+extracellular+vesicles+for+individual+multi-modal+characterization+using+AFM,+SEM+and+Raman+spectroscopy.">Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy.</a> Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).</li><li>Malenica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+microscopy+methods+for+morphology+characterisation+of+extracellular+vesicles+from+human+biofluids.">Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids.</a> Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo.">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion:+A+tool+to+improve+transfusion+safety.">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+&#171;on-chip&#187;+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles.">Development of a NanoBioAnalytical platform for &#171;on-chip&#187; qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li><li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles.">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li><li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis.">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).</li><li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM:+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM.">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).</li><li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicle+(EV)+Array:+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping.">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).</li><li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+(SUPRA-MS):+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma.">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li><li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+lipids:+A+review.">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li><li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers.">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li><li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing.">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li><li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging.">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246 (2016).</li><li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles.">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li></ol>

השיטות האחרונות לזיהוי EV שנמצאות בשימוש הנרחב ביותר הן אימונובלוטינג ספציפי לחלבון כדי לאשר את מקורם של כלי רכב חשמליים, TEM כדי לאשר את המבנה שלהם, ונת"ע כדי לכמת את התפלגות מספרם וגודלם במדגםנפח 3. עם זאת, העניין הרב ברכבים חשמליים במחקר (ביו)רפואי והמגבלות של הכלים האנליטיים ה...

העניין הגובר במחקר EV באבחון ובטיפולים 1,2,3,4,5, בשילוב עם האתגרים העומדים בפני תחום זה, הביאו לפיתוח ויישום של מגוון רחב של גישות וטכניקות לכימות או אפיון שלפוחיות אלה. השיטות הנפוצות ביותר לזיהוי EV הן אימונובלוטציה ספציפית לחלבון ופרוטאומיקה כדי לאשר את מקורם של כלי רכב חשמליים, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) כדי לאשר את המבנה שלהם, וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) כדי לכמת את מספרם ואת התפלגות גודלם בנפח דגימה.
עם זאת, אף אחת מהטכניקות הללו כשלעצמה אינה מספקת את כל המידע הדרוש כדי לאפיין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים. ההטרוגניות המובנית של כלי רכב חשמליים בשל הגיוון בתכונות הביוכימיות והפיזיקליות שלהם מונעת ניתוחים גלובליים אמינים וניתנים לשחזור, במיוחד עבור כלי רכב חשמליים הכלולים בתערובת (מדגם גולמי). לכן, יש צורך בשיטות איתור ואפיון עבור כלי רכב חשמליים, הן באופן פרטני והן באופן כללי כדי להשלים שיטות אחרות שהן מהירות יותר אך לא סלקטיביות6.
הדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי TEM (או cryoTEM) או AFM מאפשרת לקבוע את המורפולוגיה והמטרולוגיה של כלי רכב חשמליים ברזולוציה ננומטרית 7,8,9,10,11,12. עם זאת, המגבלה העיקרית של השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים עבור אובייקטים ביולוגיים, כגון EVs, היא הצורך בוואקום לביצוע המחקר הדורש קיבוע והתייבשות של הדגימה. הכנה כזו מקשה על התרגום מהמבנים שנצפו למורפולוגיה של EV בתמיסה. כדי למנוע התייבשות זו של הדגימה, הטכניקה של cryoTEM היא המתאימה ביותר לאפיון EV13. הוא נמצא בשימוש נרחב לקביעת מבנה העל של כלי רכב חשמליים. הסימון החיסוני של שלפוחיות על ידי ננו-חלקיקי זהב ביו-פונקציונליים מאפשר גם לזהות תת-אוכלוסיות ספציפיות של כלי רכב חשמליים ולהבדיל אותן מחלקיקים אחרים הנמצאים בדגימה ביולוגית מורכבת. עם זאת, בשל המספר הנמוך של כלי רכב חשמליים המנותחים במיקרוסקופ אלקטרוני, לעיתים קרובות קשה לבצע אפיון המייצג מדגם מורכב והטרוגני.
כדי לחשוף את ההטרוגניות בגודל זה, האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות (ISEV) מציעה לנתח מספר מספיק של תמונות שדה רחב, בליווי תמונות קטנות יותר, כדי לחשוף כלי רכב חשמליים בודדים ברזולוציה גבוהה14. AFM הוא חלופה לגישות אופטיות וטכניקות עקיפה אלקטרוניות לחקר כלי רכב חשמליים. טכניקה זו משתמשת בקצה חד המוחזק על ידי מקל גמיש הסורק את הדגימה שהונחה על תמיכה אחת, שורה אחר שורה, ומתאים את המרחק בין הקצה לבין האלמנטים הנוכחים באמצעות לולאת משוב. זה מאפשר לאפיין את הטופוגרפיה של המדגם ולאסוף מידע מורפומכני15,16,17,18. ניתן לסרוק את כלי הרכב החשמליים על ידי AFM לאחר שהופקדו על מצע שטוח אטומית או לאחר שנלכדו על מצע ספציפי המתפקד על ידי נוגדנים, פפטידים או אפטמרים כדי לאפיין את תת-האוכלוסיות השונות18,19. בשל יכולתו לכמת ובו זמנית את המבנה, הביומכניקה והתכולה הביומולקולרית הממברנית של כלי רכב חשמליים בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות ללא צורך בטיפול מקדים, תיוג או התייבשות, AFM משמש כיום יותר ויותר לאפיון כלי רכב חשמליים בצורה עדינה ורב-פרמטרית בתנאים פיזיולוגיים של טמפרטורה ומדיום.
מאמר זה מציע מתודולוגיה המשתמשת בביו-שבב זהב ליבה המסוגל להיות (ביו) פונקציונלי כימית בפורמט מרובה. מצע זה הוא אבן הפינה של פלטפורמה אנליטית רבת עוצמה המשלבת זיהוי ביולוגי של תת-קבוצות EV על ידי תהודה פלסמונית על פני השטח, וברגע שכלי הרכב החשמליים נספגים/מושתלים או נלכדים חיסון על השבב, AFM מאפשר אפיון מטרולוגי ומורפומכני של כלי הרכב החשמליים. יחד עם חתימת ראמאן של תת-קבוצות הרכב החשמלי שנלכדו על השבב, פלטפורמה אנליטית זו מאפשרת את ההסמכה של כלי הרכב החשמליים הנמצאים בדגימות ביולוגיות באופן ללא תוויות וללא כל צורך בצעדים פרה-אנליטיים. מאמר זה מראה כי השילוב של טכניקות רבות-עוצמה, בסיוע מתודולוגיה קפדנית ביותר בהכנת מצעים ורכישת נתונים, הופך את ניתוח הרכב החשמלי לעמוק, מוחלט וחזק.
העיקרון של הגישה המוצעת הוא להכין מצע זהב, לספוח/להשתיל או ללכוד את תת-הסוגים של EV, ולסרוק אותם על ידי AFM כדי להעריך את הגודל והמורפולוגיה של כל תת-קבוצה של EV. בנוסף, כלי הרכב החשמליים הנספחים מנותחים על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. מצע זה יכול, אכן, להציג שלושה סוגים של ממשקים בעלי מורכבות הולכת וגדלה: עירום, פונקציונלי כימית, או מיקרו-מערכי ליגנד. לפני תיאור השלבים השונים של הפרוטוקול, הקוראים מופנים להצגה הסכמטית של גישת הפלטפורמה הננו-ביואנליטית (NBA) באיור 1, המשלבת דימות תהודה פלסמוני פני השטח (SPRi), AFM וספקטרוסקופיה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> איור 1: הפלטפורמה הננו-ביואנליטית. הגישה משלבת (A) הדמיית תהודה פלסמונית על פני השטח, (B) מיקרוסקופ כוח אטומי, וספקטרוסקופיית אינפרא אדום/ראמאן (ננו), כולם עוסקים על אותו מצע - שבב זהב מרובה. קיצורים: NBA = פלטפורמה ננו-ביואנליטית; SPRi = הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח; AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; EV = שלפוחית חוץ-תאית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ביו-שבב הזהב מהווה את לב הפלטפורמה מכיוון שכל טכניקות האפיון ללא תוויות מתבצעות על שבב זה. בהתאם לצרכים של אפיון הרכב החשמלי (תת-קבוצות גלובליות/כלל של כלי רכב חשמליים או תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים) והמגבלות/הדרישות של השיטות בהן נעשה שימוש, פותחו שלושה סוגים של משטחי ביו-שבב זהב: או "עירום", "C11/C16" המתפקד כימית, או ליגנד-ביו-פונקציונלי, המכונה משטח זהב "ליגנד".
 השבב העירום, המכונה "עירום", מאפשר ספיחה פשוטה של כלי רכב חשמליים על זהב. ניתן לבחור את המאגר המשמש ולממש ספיחה זו באופן פסיבי (שלבי דגירה ולאחר מכן שטיפה) או לפקח עליו תחת זרימה (ב SPRi). יתר על כן, ספיחה פסיבית זו יכולה להתממש או על השבב כולו (כמו macroarray) או מקומי microarrays באמצעות ספוטר micropipette. "נוהל הזרימה" מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הקינטיקה ורמת ספיחת הרכב החשמלי. גישה זו על מצע הזהב העירום מאומצת כאשר ממשק השכבה הכימית עלול להפריע לשיטה האנליטית (למשל, עבור ספקטרוסקופיית ראמאן).
 השבב הביולוגי המתפקד כימית, הנקרא "C11/C16", משמש ליצירת "שטיח" צפוף וחזק של כלי רכב חשמליים הקשורים באופן קוולנטי על פני הזהב על ידי יצירת קשרי אמיד ראשוניים עם התיולטים כאשר המטרה היא לקבל מבט גלובלי על דגימת הרכב החשמלי. ואכן, במקרה זה, הזהב מתפקד על ידי תערובת תיולאט של mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") וחומצה mercapto-1-hexadecanoic (16-MHA: "C16"), וחלק קטן של thiolates מופעלים כימית כדי ליצור קישור קוולנטי עם המטרות. שוב, אסטרטגיה זו יכולה להתממש באופן פסיבי (שלבי דגירה ולאחר מכן שטיפה, או ב"מקרו-מערך" או במספר מיקרו-מערכים באמצעות ספוטר מיקרופיפטה) או תחת קצבי זרימה (ב-SPRi) כדי לעקוב אחר הקינטיקה ורמת השתלת הרכב החשמלי על משטח הזהב.
 השבב הביולוגי של הליגנד, הנקרא "ליגנדים", מופעל כימית כדי להשתיל באופן קוולנטי ליגנדים שונים (למשל, נוגדנים, קולטנים) כדי ללכוד באופן סלקטיבי (עם זיקה) תת-קבוצות שונות של EV המתקיימות יחד בדגימה הביולוגית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD41a antibody</td>
			<td>Diaclone SAS (France)</td>
			<td>447528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP920</td>
			<td>Microparticles GmbH, Germany</td>
			<td>448303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXR3xi&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs derived from platelet concentrates</td>
			<td>Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs from bovine milk</td>
			<td>Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion&#160;</td>
			<td></td>
			<td>853.223.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetron sputtering</td>
			<td>PLASSYS</td>
			<td>SAB5300165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercapto-1-hexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercapto-1-undecanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountains SPIP ones</td>
			<td>Digital Surf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWizard 3 Bioscience&#160;</td>
			<td>Bruker-JPK&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside (OG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumine antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Albumin Serum (RSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-Biacore 3000</td>
			<td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Biochip</td>
			<td>MIMENTO technology platform</td>
			<td></td>
			<td>The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Plex II</td>
			<td>Horiba Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות זעירות שמקורן בקרום, המיוצרות על ידי כל התאים בקוטר של בין 50 לכמה מאות ננומטרים ומשמשות כאמצעי לתקשורת בין-תאית. הם מסתמנים ככלי אבחון וטיפול מבטיחים למגוון מחלות. ישנם שני תהליכי ביוגנזה עיקריים המשמשים תאים לייצור כלי רכב חשמליים עם הבדלים בגודל, בהרכב ובתוכן. בשל מורכבותם הגבוהה בגודלם, הרכבם ומוצא התא, אפיונם דורש שילוב של טכניקות אנליטיות. פרויקט זה כולל פיתוח דור חדש של פלטפורמות אנליטיות מולטי-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-אוכלוסיות של כלי רכב חשמליים. כדי להשיג מטרה זו, העבודה מתחילה מהפלטפורמה הננו-ביואנליטית (NBA) שהוקמה על ידי הקבוצה, המאפשרת חקירה מקורית של כלי רכב חשמליים המבוססת על שילוב של שיטות ביו-חישה מרובות עם ניתוחים מטרולוגיים ומורפומכניים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) של מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך. המטרה הייתה להשלים את חקירת הרכב החשמלי באמצעות ניתוח פנוטיפי ומולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. פיתוחים אלה מאפשרים להציע פתרון אנליטי רב-מודאלי וקל לשימוש להבחנה בין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים בנוזלים ביולוגיים בעלי פוטנציאל קליני

קביעת תנאי החומציות האופטימליים להשתלת ליגנד הליגנדות השונות שמשמשות להכנת הביו-שבבים נבדקות כפונקציה של ה-pH והזמינות שלהן לאינטראקציה עם השכבה הכימית של תיולאט (איור 3). הליגנדות מדוללות במאגר אצטט בערכי pH שונים ומוזרקות על השבב הביולוגי המתפקד כימית עם שכבת C1...

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.

פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

האופי המורכב של כלי רכב חשמליים מקשה על זיהוי תת-האוכלוסייה המעניינת, ופרוטוקול זה יכול לזהות אותם באמצעות הפנוטיפ, פרופיל הגודל והתכונות הננו-מכניות שלהם. שילוב זה של טכניקה הוא שיטה ללא תוויות, המאפשרת לנו לזהות כלי רכב חשמליים בזמן אמת ממצב, מדיה ופלסמה בדם. טכניקה זו מאפשרת לאפיין תת-קבוצה עמוקה של ננו-חלקיקים בעלי עניין, על מנת לשמש כאינדיקטורים ביולוגיים של פתולוגיה, או לשמש גם כננו-חלקיקים לאספקת תרופות.מכיוון שמדובר בשיטה רגישה מאוד, חובה לשים לב להכנת הביו-שבב לפני הזרקת הדגימה המעניינת אותך. לאחר ציפוי ותפקוד השבבים, יש לדגור על השבב הביולוגי בתערובת של 200 מילימולר אתיל דימתילאמינופרופיל קרבודימיד/N-הידרוקסיסוקסינימיד ו-50 מילימולר לליטר N-הידרוקסיסוקסינימיד למשך 30 דקות לפחות בחושך בטמפרטורת החדר. באמצעות הספוטר, מוסיפים 300 ננוליטר של תמיסת ליגנד ודגרים על השבב הביולוגי תחת אמבטיה קולית למשך 30 דקות.שטפו את השבב הביולוגי מלמעלה במים טהורים במיוחד. הוסיפו טיפת שמן עם מקדם שבירה זהה לזה של המנסרה כדי ליצור שכבה דקה אחידה בין השבב למנסרה, והניחו אותה בעדינות על מנסרה עם אותו מקדם שבירה כמו השבב הביולוגי. להדמיית תהודה פלסמונית משטחית, הרכיבו את השבב הביולוגי על מערכת SPRi.נווט לתפריט הנפתח בצד שמאל של התוכנה ולחץ על ספריית העבודה. מצאו את התמונה במקומות שבהם נקודות שונות גלויות, ולחצו לבחירת תמונה זו. לאחר מכן כתוב את שם משפחות הליגנדים, ולחץ על הגדרת המינים Finish.גרור את הקו השחור עם הסמן לזווית העבודה האופטימלית. לחצו על 'הזז שיקוף לזווית עבודה' ובחרו זווית עבודה. עכשיו לחץ על Kinetics.כאשר התוכנה מבקשת מהמשתמש להגדיר את הפקד השלילי, בחר ללא שליטה שלילית בשלב זה. הזריקו אלבומין בסרום חולדות בטמפרטורה של 50 מיקרוליטר לדקה למשך ארבע דקות. הזריקו אתנולמין במהירות של 20 מיקרוליטר לדקה למשך 10 דקות כדי להשבית את קבוצות הקרבוקסיליות שעדיין קיימות ומגיבות על פני השטח.לאחר מכן, לשטוף את השבב הביולוגי על ידי הזרקת 40 מילימולר OG ב 50 מיקרוליטר לדקה במשך ארבע דקות. הזריקו את השלפוחיות החוץ תאיות בריכוז מסוים על השבב הביו-פונקציונלי תוך מעקב אחר הקינטיקה של האינטראקציה של השלפוחיות על הנקודות השונות, בו זמנית. כמו כן לקבוע את הערך של רפלקטיביות ואת רמת האינטראקציה.לאחר הייצוב, הזריקו גלוטראלדהיד על השבב כדי לקבע בועיות חוץ-תאיות במקום שבו הן נמצאות לפני ביצוע הדמיית AFM. יישרו את השבב הביולוגי בחלק העליון של המסכה במגלשת הזכוכית. השתמש במצלמת CCD על גבי AFM כדי למקם את המזנון במקום הנכון שיש לסרוק.התחל את רכישת AFM במצב מגע משלושה עד חמישה אזורים גדולים לקטנים. לאחר מכן, טפל בתמונות AFM באמצעות תוכנת עיבוד נתונים JPK על ידי בחירת ערוץ הגובה תחילה. בחר התאמה פולינומית שיש להחסיר מכל שורה כדי לקבל קווי סריקה מיושרים.בחר את סף הגובה על גרגרי זהב כדי למנוע את החספוס על פני השטח. מודול מיצוי הדגנים מסמן את הגרגרים באמצעות סף גובה של 8.5 ננומטר. ביו-שבבים מרובי שבבים נותחו לאחר פסיבציה של אלבומין.השבב ללא ברירת מחדל. השבב עם כמה פגמים, עקב היתוך של כתמים, רפטינג חלש, או בועות או מזהמים. ושבב זהב עירום ללא מיקרו-מערכים לבחינת ספיחת שלפוחיות חוץ-תאיות על זהב מוצג.ניסוי הלכידה על שבב ביולוגי מרובה רבבים הראה אותות החזרה טובים עבור ליגנדות שונות, ויחס אות לרעש טוב עבור הליגנדות השונות, מכיוון שתגובת הבקרה השלילית הייתה זניחה. ספיחת שלפוחית חוץ-תאית לאחר הזרקת דגימת השלפוחית החוץ-תאית הציגה אות החזרה גבוה, דבר המצביע על כך ששלפוחיות אלה היו מסוגלות לספוח ולהישאר יציבות על שבב הזהב. לאחר העמסת שלפוחיות חוץ-תאיות, נוצרו תמונות AFM בקנה מידה גדול ובקנה מידה קטן של שלפוחיות חוץ-תאיות על שבבים ביולוגיים.מבט מקרוב ברזולוציה גבוהה מאפשר מטרולוגיה של שלפוחיות חוץ-תאיות. הקוטר האפקטיבי של השלפוחיות החוץ תאיות על שבב ביולוגי נע בין 30 ל -300 ננומטר, כאשר הרוב הגדול סביב 60 ננומטר. התוצאות שהתקבלו באוויר ובנוזל היו דומות.ספקטרום הרמאן של שלפוחיות חוץ-תאיות שנספחו על שבב עירום חשף ספקטרום ברור, עם פסגות המתאימות בעיקר לתנודות מתילן, הקשורות לשומנים של קרומי שלפוחית חוץ-תאיים. חשוב להכין את השבב הביולוגי שלכם בקפדנות על מנת שתוכלו לזהות את כלי הרכב החשמליים שלכם בצורה מדויקת וניתנת לשחזור. ניתן להשתמש בשיטות קונבנציונליות כמו ניתוח כתמים מערביים ומעקב אחר ננו-חלקיקים כדי לתאם ולאשר פנוטיפים ודפוסי גודל.יתר על כן, ניתוחים רב-אומיים צפויים אפילו להעמיק באפיון מולקולרי של EV ובאפליה פוטנציאלית של תת-קבוצות.

Research

JoVE Journal

Biology

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

הדמיה עצמים ללא עדשה על שבב של תאים מספק כלי חדש לביולוגיה-Cell תפוקה גבוהה ואבחון רפואי

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ&quot;א

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...