Name: multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Kelly Aubertin og Fabien Picot fra IVETh-kjernefasiliteten (Paris) er anerkjent for Raman-avbildningseksperimentene. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) og Zuzana Krupova (fra Helincourt, Frankrike) er anerkjent for å ha levert EV-prøvene avledet fra henholdsvis blodplate- og storfemelkprøver. Arbeidet ble støttet av regionen Bourgogne Franche-Comté og EUR EIPHI graduate school (NOVICE prosjekt, 2021-2024). En del av dette arbeidet ble gjort ved hjelp av CLIPP-plattformen og i RENATECHs renromsfasiliteter i FEMTO-ENGINEERING, som vi takker Rabah Zeggari for.

1. Forberedelse av gullsubstrat
MERK: Tre typer overflater er produsert på gullflis: 1) naken overflate, 2) kjemisk funksjonalisert og 3) biofunksjonalisert (ligander podet på C11C16 lag). De vil bli kalt henholdsvis "naken", "C11C16" og "ligander" fra dette tidspunktet og fremover.
<ol><li>Forberedelse av gullsubstrat: MERK: For denne protokollen ble gullbiochips produsert internt i renrommet. De hjemmelagde biochipene...

<ol>
	<li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products:+A+position+paper+of+the+group+&amp;#34;Extracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France&amp;#34;.">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &amp;#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&amp;#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).</li><li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes.">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li><li>Hartjes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+vesicles+as+emerging+theranostic+nanoplatforms.">Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms.</a> Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).</li><li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations.">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).</li><li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Definition,+isolation+and+characterization.">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li><li>Brisson, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+activated+platelets:+A+semiquantitative+cryo-electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+study.">Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study.</a> Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+A+novel+approach+to+the+detection+of+nanosized+blood+microparticles.">Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).</li><li>Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., P&#233;try, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensional+characterization+of+extracellular+vesicles+using+atomic+force+microscopy.">Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy.</a> Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).</li><li>Beekman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-capture+of+extracellular+vesicles+for+individual+multi-modal+characterization+using+AFM,+SEM+and+Raman+spectroscopy.">Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy.</a> Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).</li><li>Malenica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+microscopy+methods+for+morphology+characterisation+of+extracellular+vesicles+from+human+biofluids.">Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids.</a> Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo.">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion:+A+tool+to+improve+transfusion+safety.">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+&#171;on-chip&#187;+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles.">Development of a NanoBioAnalytical platform for &#171;on-chip&#187; qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li><li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles.">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li><li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis.">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).</li><li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM:+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM.">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).</li><li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicle+(EV)+Array:+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping.">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).</li><li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+(SUPRA-MS):+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma.">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li><li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+lipids:+A+review.">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li><li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers.">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li><li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing.">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li><li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging.">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246 (2016).</li><li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles.">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li></ol>

De siste metodene for EV-identifikasjon som er de mest brukte, er proteinspesifikk immunoblotting for å bekrefte opprinnelsen til EV, TEM for å bekrefte strukturen og NTA for å kvantifisere antall og størrelsesfordeling i et prøvevolum3. Likevel har den høye interessen for elbiler i (bio) medisinsk forskning og begrensningene i eksisterende analytiske verktøy bedt det vitenskapelige samfunnet om å utvikle nye metoder for EV-karakterisering, diskriminering og kvantifisering.
<p class="j...

Den økende interessen for EV-forskning i diagnose og terapeutikk 1,2,3,4,5, kombinert med utfordringene dette feltet står overfor, har resultert i utvikling og implementering av et stort utvalg av tilnærminger og teknikker for å kvantifisere eller karakterisere disse vesiklene. De mest brukte metodene for EV-identifikasjon er proteinspesifikk immunoblotting og proteomikk for å bekrefte opprinnelsen til EV, transmisjonselektronmikroskopi (TEM) for å bekrefte strukturen og nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) for å kvantifisere antall og størrelsesfordeling i et prøvevolum.
Ingen av disse teknikkene alene gir imidlertid all den informasjonen som kreves for å karakterisere EV-delmengder. Den iboende heterogeniteten til elbiler på grunn av mangfoldet i deres biokjemiske og fysiske egenskaper hindrer globale analyser som er pålitelige og reproduserbare, spesielt for elbiler som finnes i en blanding (råprøve). Deteksjons- og karakteriseringsmetoder er derfor nødvendig for elbiler, både individuelt og generelt for å utfylle andre metoder som er raskere, men ikke selektive6.
Høyoppløselig avbildning av TEM (eller cryoTEM) eller AFM tillater bestemmelse av morfologi og metrologi av EV med en nanometrisk oppløsning 7,8,9,10,11,12. Imidlertid er hovedbegrensningen ved bruk av elektronmikroskopi for biologiske objekter, som EV, behovet for et vakuum for å utføre studien som krever fiksering og dehydrering av prøven. Et slikt preparat gjør det vanskelig å oversette fra strukturene observert til EV-morfologien i løsningen. For å unngå denne dehydreringen av prøven, er teknikken til cryoTEM den mest egnede for EV-karakterisering13. Det er mye brukt for å bestemme ultrastrukturen til elbiler. Immunmerkingen av vesikler ved biofunksjonaliserte gullnanopartikler gjør det også mulig å identifisere spesifikke underpopulasjoner av EV og skille dem fra andre partikler som er tilstede i en kompleks biologisk prøve. På grunn av det lave antallet elbiler som analyseres ved elektronisk mikroskopi, er det imidlertid ofte vanskelig å utføre en karakterisering som er representativ for en kompleks og heterogen prøve.
For å avsløre denne størrelsesheterogeniteten foreslår International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) å analysere et tilstrekkelig antall vidvinkelbilder, ledsaget av mindre bilder, for å avsløre individuelle elbiler med høy oppløsning14. AFM er et alternativ til optiske tilnærminger og elektroniske diffraksjonsteknikker for studier av elbiler. Denne teknikken bruker en skarp spiss som holdes av en fleksibel utkrager som skanner prøven som er avsatt på en støtte, linje for linje, og justerer avstanden mellom spissen og elementene som er tilstede gjennom en tilbakemeldingssløyfe. Dette gjør det mulig å karakterisere prøvens topografi og samle morfomekanisk informasjon15,16,17,18. EV-ene kan skannes av AFM enten etter å ha blitt avsatt på et atomisk flatt substrat eller etter å ha blitt fanget på et spesifikt substrat funksjonalisert av antistoffer, peptider eller aptamere for å karakterisere de forskjellige underpopulasjonene18,19. På grunn av sin evne til å kvantifisere og samtidig undersøke strukturen, biomekanikken og membranøs biomolekylalt innhold av EV i komplekse biologiske prøver uten behov for forbehandling, merking eller dehydrering, brukes AFM nå i økende grad til å karakterisere EV på en fin og multiparametrisk måte under fysiologiske forhold av temperatur og medium.
Dette papiret foreslår en metodikk ved hjelp av en kjerne gull biochip stand til å være (bio) kjemisk funksjonalisert i et multiplekset format. Dette substratet er hjørnesteinen i en kraftig analytisk plattform som kombinerer biodeteksjon av EV-undergrupper ved overflateplasmonresonans, og når elbilene er adsorbert/podet eller immunfanget på brikken, muliggjør AFM metrologisk og morfomekanisk karakterisering av elbilene. Sammen med Raman-signaturen til EV-undergruppene fanget på brikken, gjør denne analytiske plattformen det mulig å kvalifisere elbilene som er tilstede i biologiske prøver på en etikettfri måte og uten behov for preanalytiske trinn. Dette papiret viser at kombinasjonen av kraftige teknikker, assistert av en svært streng metodikk i substratforberedelse og datainnsamling, gjør EV-analysen dyp, definitiv og robust.
Prinsippet for den foreslåtte tilnærmingen er å forberede et gullsubstrat, å adsorbere / pode eller fange EV-undertypene, og å skanne dem med AFM for å estimere størrelsen og morfologien til hver EV-delmengde. I tillegg analyseres de adsorberte elbilene ved Raman-spektroskopi. Dette substratet kan faktisk presentere tre typer grensesnitt med økende kompleksitet: nakne, kjemisk funksjonaliserte eller ligandmikromatriser. Før de beskriver de forskjellige trinnene i protokollen, blir leserne henvist til den skjematiske presentasjonen av nanobioanalytisk plattform (NBA) tilnærming i figur 1, som kombinerer overflateplasmonresonansavbildning (SPRi), AFM og spektroskopi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> Figur 1: NanoBioAnalytisk plattform. Tilnærmingen kombinerer (A) overflateplasmonresonansavbildning, (B) atomkraftmikroskopi og infrarød / Raman (nano) spektroskopi, alle engasjert på samme substrat - en multiplekset gullbrikke. Forkortelser: NBA = NanoBioAnalytisk plattform; SPRi = overflateplasmon resonans imaging; AFM = atomkraftmikroskopi; EV = ekstracellulær vesikkel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Kjernen gull biochip utgjør hjertet av plattformen siden alle etikettfrie karakteriseringsteknikker utføres på denne biochipen. I henhold til behovene til EV-karakteriseringen (enten globale / totale EV-er eller EV-undergrupper) og begrensningene / kravene til metodene som brukes, har tre typer gullbiochipoverflater blitt utviklet: enten "naken", kjemisk funksjonalisert "C11 / C16" eller ligandbiofunksjonalisert, kalt "ligand" gulloverflate.
Den nakne biochipen, kalt "naken", muliggjør enkel adsorpsjon av elbiler på gull. Det er mulig å velge bufferen som brukes og realisere denne adsorpsjonen enten på en passiv måte (inkubasjon og deretter skylletrinn) eller for å overvåke den under strømning (i SPRi). Videre kan denne passive adsorpsjonen realiseres enten på hele brikken (som en makromatrise) eller lokalisert i mikromatriser ved hjelp av en mikropipettespotter. "Under flow-prosedyren" gjør det mulig for etterforskere å følge kinetikken og nivået av EV-adsorpsjon. Denne tilnærmingen på det nakne gullsubstratet tas i bruk når det kjemiske laggrensesnittet kan forstyrre analysemetoden (f.eks. for Raman-spektroskopi).
Den kjemisk funksjonaliserte biochipen, kalt "C11 / C16", brukes til å skape et tett og robust "teppe" av EVer kovalent bundet på gulloverflaten ved å danne primære amidbindinger med tiolater når målet er å få et globalt syn på EV-prøven. Faktisk, i dette tilfellet funksjonaliseres gullet av en tiolat blanding av merkapto-1-undekanol (11-MUOH: "C11") og merkapto-1-heksadekansyre (16-MHA: "C16"), og en brøkdel av tiolatene aktiveres kjemisk for å etablere kovalent binding med målene. Igjen kan denne strategien realiseres enten passivt (inkubasjon og deretter skylletrinn, enten i "makromatrise" eller i flere mikromatriser ved bruk av en mikropipettespotter) eller under strømningshastigheter (i SPRi) for å følge kinetikken og nivået av EV-poding på gulloverflaten.
Den ligand-biofunksjonaliserte biochip, kalt "ligander", aktiveres kjemisk for å kovalent pode forskjellige ligander (f.eks. antistoffer, reseptorer) for selektivt å fange (med affinitet) forskjellige EV-undergrupper som sameksisterer i den biologiske prøven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD41a antibody</td>
			<td>Diaclone SAS (France)</td>
			<td>447528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP920</td>
			<td>Microparticles GmbH, Germany</td>
			<td>448303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXR3xi&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs derived from platelet concentrates</td>
			<td>Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs from bovine milk</td>
			<td>Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion&#160;</td>
			<td></td>
			<td>853.223.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetron sputtering</td>
			<td>PLASSYS</td>
			<td>SAB5300165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercapto-1-hexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercapto-1-undecanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountains SPIP ones</td>
			<td>Digital Surf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWizard 3 Bioscience&#160;</td>
			<td>Bruker-JPK&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside (OG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumine antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Albumin Serum (RSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-Biacore 3000</td>
			<td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Biochip</td>
			<td>MIMENTO technology platform</td>
			<td></td>
			<td>The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Plex II</td>
			<td>Horiba Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets

Ekstracellulære vesikler (EV) er membranavledede, små vesikler produsert av alle celler som varierer fra 50 til flere hundre nanometer i diameter og brukes som et middel til intercellulær kommunikasjon. De fremstår som lovende diagnostiske og terapeutiske verktøy for en rekke sykdommer. Det er to hovedbiogeneseprosesser som brukes av celler for å produsere elbiler med forskjeller i størrelse, sammensetning og innhold. På grunn av deres høye kompleksitet i størrelse, sammensetning og celleopprinnelse, krever karakteriseringen en kombinasjon av analytiske teknikker. Dette prosjektet innebærer utvikling av en ny generasjon multiparametriske analyseplattformer med økt gjennomstrømning for karakterisering av underpopulasjoner av elbiler. For å oppnå dette målet starter arbeidet fra nanobioanalytisk plattform (NBA) etablert av gruppen, som tillater en original undersøkelse av EV basert på en kombinasjon av multipleksede biosensingsmetoder med metrologiske og morfomekaniske analyser ved atomkraftmikroskopi (AFM) av vesikulære mål fanget på en microarray biochip. Målet var å fullføre denne EV-undersøkelsen med en fenotypisk og molekylær analyse ved Raman-spektroskopi. Disse utviklingene gjør det mulig å foreslå en multimodal og brukervennlig analytisk løsning for diskriminering av EV-undergrupper i biologiske væsker med klinisk potensial

Bestemmelse av optimale pH-forhold for ligandtransplantasjon De forskjellige ligandene som brukes til å forberede biochipsene testes som en funksjon av pH og deres tilgjengelighet til å interagere med det tiolat kjemiske laget (figur 3). Ligandene fortynnes i acetatbuffer ved forskjellige pH-verdier og injiseres på biochipet kjemisk funksjonalisert med et C11C16-lag. Løsningene injiseres tilfeldig på overflaten, og et vaskemiddel (OG ved 40 mM) injiseres etter hver l...

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Dette papiret foreslår en ny generasjon multiparametriske analytiske plattformer med økt gjennomstrømning for karakterisering av ekstracellulære vesikelundergrupper. Metoden er basert på en kombinasjon av multipleksede biosensingsmetoder med metrologiske og morfomekaniske analyser ved atomkraftmikroskopi, kombinert med Raman-spektroskopi, for å kvalifisere vesikulære mål fanget på en mikroarray-biochip.

Multimodal analytisk plattform på en multiplekset overflateplasmon resonans imaging chip for analyse av ekstracellulære vesikkelundergrupper

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Den komplekse naturen til elbiler gjør det vanskelig å gjenkjenne underpopulasjonen av interesse, og denne protokollen kan oppdage dem med fenotype, størrelsesprofil og nanomekaniske egenskaper. Denne kombinasjonen av teknikk er en merkefri metode, som gjør at vi kan oppdage elbiler i sanntid fra tilstandsmediet og blodplasma. Denne teknikken gjør det mulig å karakterisere dypt delmengde av nanopartikler av interesse, for å bli brukt som bioindikatorer for patologi, eller også brukt som nanopartikkel for legemiddellevering.Siden det er en veldig følsom metode, er det viktig å være oppmerksom på biochippreparatet før du injiserer prøven av interesse. Etter å ha belagt og funksjonalisert sjetongene, inkuber biochipet i en blanding av 200 millimolar etyldimetylaminopropylkarbodiimid/N-hydroksysuccinimid og 50 millimolar per liter N-hydroksysuccinimid i minst 30 minutter i mørket ved romtemperatur. Bruk spotteren, tilsett 300 nanoliter ligandoppløsning og inkuber biochipet under et sonisk bad i 30 minutter.Vask biochipen fra toppen med ultrarent vann. Tilsett en dråpe olje med samme brytningsindeks som prismet for å skape et jevnt tynt lag mellom biochipet og prismet, og legg det forsiktig på et prisme med samme brytningsindeks som biochipet. For overflateplasmonresonansavbildning, monter biochipet på SPRi-systemet.Naviger til rullegardinmenyen på venstre side av programvaren, og klikk på Arbeidskatalog. Finn bildet der forskjellige flekker er synlige, og klikk for å velge dette bildet. Skriv deretter navnet på ligandfamiliene, og klikk på Finish-artsdefinisjonen.Dra den svarte linjen med markøren til optimal arbeidsvinkel. Klikk på Flytt speilet til arbeidsvinkel, og velg en arbeidsvinkel. Klikk nå på Kinetikk.Når programvaren ber brukeren om å definere den negative kontrollen, velger du Ingen negativ kontroll på dette tidspunktet. Injiser rotteserum albumin ved 50 mikroliter per minutt i fire minutter. Injiser etanolamin ved 20 mikroliter per minutt i 10 minutter for å deaktivere karboksylgruppene som fortsatt er tilstede og reaktive på overflaten.Etterpå vasker du biochipen ved å injisere 40 millimolar OG ved 50 mikroliter per minutt i fire minutter. Injiser de ekstracellulære vesiklene ved en bestemt konsentrasjon på den biofunksjonaliserte brikken mens du følger kinetikken til samspillet mellom vesikler på de forskjellige stedene samtidig. Bestem også verdien av reflektivitet og samspillsnivået.Når stabilisert, injiser glutaraldehyd på brikken for å fikse ekstracellulære vesikler på stedet de er før du gjør AFM-avbildning. Juster biochipen på toppen av masken på glassglasset. Bruk CCD-kameraet på toppen av AFM for å lokalisere utkrageren på riktig sted som må skannes.Start AFM-anskaffelsen i kontaktmodus fra tre til fem store til små områder. Deretter behandler du AFM-bildene med JPK-databehandlingsprogramvare ved først å velge høydekanalen. Velg en polynomtilpasning som skal trekkes fra hver linje for å få rettede skannelinjer.Velg høydeterskelen på gullkorn for å eliminere ruheten på overflaten. Kornutvinningsmodulen markerer kornene ved hjelp av en høydeterskel på 8,5 nanometer. Multipleksede biochips ble analysert etter albuminpassivering.Brikken uten standard. Brikken med noen feil, på grunn av fusjon av flekker, svak podning eller bobler eller forurensninger. Og en naken gullbrikke uten mikromatriser for å undersøke adsorpsjonen av ekstracellulære vesikler på gull er vist.Fangsteksperimentet på en multiplekset biochip viste gode reflektivitetssignaler for forskjellige ligander, og et godt signal-støyforhold for de forskjellige ligandene, siden responsen til den negative kontrollen var ubetydelig. Ekstracellulær vesikkeladsorpsjon etter injeksjon av den ekstracellulære vesikkelprøven viste høyt reflektivitetssignal, noe som tyder på at disse vesiklene var i stand til å adsorbere og forbli stabile på gullbrikken. Etter ekstracellulær vesikkelbelastning ble de store og småskala AFM-bildene av ekstracellulære vesikler på biochips generert.En høyoppløselig nærmere visning muliggjør metrologi av ekstracellulære vesikler. Den effektive diameteren av de ekstracellulære vesiklene på en biochip varierte fra 30 til 300 nanometer, med et stort flertall rundt 60 nanometer. Resultatene oppnådd i luft og væske var sammenlignbare.Raman-spekteret av ekstracellulære vesikler adsorbert på en naken chip avslørte et klart spektrum, med topper som hovedsakelig svarer til metylenvibrasjoner, som er forbundet med lipidene av ekstracellulære vesikkelmembraner. Det er viktig å forberede biochipen din grundig for å kunne oppdage elbilene dine nøyaktig og på en reproduserbar måte. Konvensjonelle metoder som vestlig blotting og nanopartikkelsporingsanalyse kan engasjeres for å korrelere og bekrefte fenotyper og størrelsesmønstre.Videre er multi-omiske analyser tenkt å gå enda dypere inn i EV-molekylær karakterisering og potensiell delmengdediskriminering.

Research

JoVE Journal

Biology

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Grådighet-basert Ekstracellulær Interaction Screening (AVEXIS) for Scalable Detection of Low-affinitet ekstracellulære Receptor-ligand interaksjoner

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA berikelse av en Transposase-basert teknologi for NGS Analyse av hele sekvensen av<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, og ni gener involvert i DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Real Time Målinger av Membrane Protein: Receptor Interaksjoner Bruke Surface plasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av Ekstracellulære Matrix Proteiner fra Vev og Fordøyelse inn Peptider for massespektrometrianalyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Måling og analyse av Ekstracellulær Acid Produksjon fastslår glykolyttiske Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikkelsporingsanalyse for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av ekstracellulære vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...