Name: multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00
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Kelly Aubertin e Fabien Picot, da instalação central do IVETh (Paris), são reconhecidas pelos experimentos de imagem Raman. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) e Zuzana Krupova (de Helincourt, França) são reconhecidos por fornecer as amostras de EV derivadas de amostras de plaquetas sanguíneas e leite bovino, respectivamente. O trabalho foi apoiado pela região de Bourgogne Franche-Comté e pela escola de pós-graduação EUR EIPHI (projeto NOVICE, 2021-2024). Parte deste trabalho foi feito usando a plataforma CLIPP e nas instalações de sala limpa da RENATECH na FEMTO-ENGINEERING, pelas quais agradecemos a Rabah Zeggari.

1. Preparação do substrato de ouro
NOTA: Três tipos de superfícies são produzidas em lascas de ouro: 1) superfície nua, 2) quimicamente funcionalizada e 3) biofuncionalizada (ligantes enxertados na camada C11C16). Eles serão chamados de "nus", "C11C16" e "ligantes", respectivamente, a partir deste ponto.
<ol><li>Preparação do substrato de ouro: NOTA: Para este protocolo, os biochips de ouro foram fabricados inter...

<ol>
	<li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products:+A+position+paper+of+the+group+&amp;#34;Extracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France&amp;#34;.">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &amp;#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&amp;#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).</li><li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes.">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li><li>Hartjes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+vesicles+as+emerging+theranostic+nanoplatforms.">Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms.</a> Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).</li><li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations.">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).</li><li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Definition,+isolation+and+characterization.">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li><li>Brisson, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo.">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion:+A+tool+to+improve+transfusion+safety.">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+&#171;on-chip&#187;+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles.">Development of a NanoBioAnalytical platform for &#171;on-chip&#187; qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li><li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles.">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li><li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis.">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).</li><li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM:+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM.">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).</li><li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicle+(EV)+Array:+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping.">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).</li><li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+(SUPRA-MS):+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma.">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li><li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+lipids:+A+review.">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li><li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers.">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li><li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing.">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li><li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging.">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246 (2016).</li><li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles.">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li></ol>

Os métodos recentes para identificação de EV que são os mais amplamente utilizados são imunoblotting específico de proteína para confirmar a origem de EVs, TEM para confirmar sua estrutura e NTA para quantificar seu número e distribuição de tamanho em um volume de amostra3. No entanto, o alto interesse em VEs em pesquisa (bio)médica e as limitações das ferramentas analíticas existentes levaram a comunidade científica a desenvolver novos métodos para caracterização, discriminaçã...

O crescente interesse na pesquisa de EV em diagnóstico e terapêutica 1,2,3,4,5, aliado aos desafios enfrentados por esse campo, resultou no desenvolvimento e implementação de uma grande variedade de abordagens e técnicas para quantificar ou caracterizar essas vesículas. Os métodos mais utilizados para a identificação de EV são imunoblotting e proteômica específicos de proteínas para confirmar a origem dos EVs, microscopia eletrônica de transmissão (MET) para confirmar sua estrutura e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para quantificar sua distribuição de número e tamanho em um volume de amostra.
Nenhuma dessas técnicas, por si só, no entanto, fornece todas as informações necessárias para caracterizar os subconjuntos de EV. A heterogeneidade inerente dos VEs devido à diversidade em suas propriedades bioquímicas e físicas impede análises globais confiáveis e reprodutíveis, especialmente para EVs contidos em uma mistura (amostra bruta). Métodos de detecção e caracterização são, portanto, necessários para os VEs, tanto individualmente quanto em geral, para complementar outros métodos mais rápidos, mas não seletivos6.
A imagem de alta resolução por MET (ou cryoTEM) ou AFM permite a determinação da morfologia e metrologia de EVs com resolução nanométrica 7,8,9,10,11,12. No entanto, a principal limitação do uso da microscopia eletrônica para objetos biológicos, como os EVs, é a necessidade de um vácuo para realizar o estudo, o que requer a fixação e desidratação da amostra. Tal preparo dificulta a tradução das estruturas observadas para a morfologia do VE em solução. Para evitar essa desidratação da amostra, a técnica de crioTEM é a mais adequada para caracterização do VE13. É amplamente utilizado para determinar a ultraestrutura dos VEs. A imunomarcação de vesículas por nanopartículas de ouro biofuncionalizadas também permite identificar subpopulações específicas de EVs e distingui-las de outras partículas presentes em uma amostra biológica complexa. No entanto, devido ao baixo número de EVs analisados por microscopia eletrônica, muitas vezes é difícil realizar uma caracterização que seja representativa de uma amostra complexa e heterogênea.
Para revelar essa heterogeneidade de tamanho, a International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) sugere a análise de um número suficiente de imagens de campo amplo, acompanhadas de imagens menores, para revelar EVs individuais com alta resolução14. O AFM é uma alternativa às abordagens ópticas e técnicas de difração eletrônica para o estudo de VEs. Esta técnica usa uma ponta afiada mantida por um cantilever flexível que digitaliza a amostra depositada em um suporte, linha por linha, e ajusta a distância entre a ponta e os elementos presentes através de um loop de feedback. Isso permite caracterizar a topografia da amostra e coletar informações morfomecânicas15,16,17,18. Os EVs podem ser escaneados por AFM após serem depositados em um substrato atomicamente plano ou após terem sido capturados em um substrato específico funcionalizado por anticorpos, peptídeos ou aptâmeros para caracterizar as várias subpopulações18,19. Devido à sua capacidade de quantificar e sondar simultaneamente a estrutura, a biomecânica e o conteúdo biomolecular membranoso de EVs dentro de amostras biológicas complexas sem a necessidade de pré-tratamento, marcação ou desidratação, o AFM é agora cada vez mais usado para caracterizar EVs de maneira fina e multiparamétrica sob condições fisiológicas de temperatura e meio.
Este trabalho propõe uma metodologia utilizando um núcleo de biochip de ouro capaz de ser (bio)quimicamente funcionalizado em um formato multiplexado. Este substrato é a pedra angular de uma poderosa plataforma analítica que combina a biodetecção de subconjuntos de EV por ressonância plasmônica de superfície e, uma vez que os EVs são adsorvidos / enxertados ou imunocapturados no chip, o AFM permite a caracterização metrológica e morfomecânica dos EVs. Juntamente com a assinatura Raman dos subconjuntos EV capturados no chip, esta plataforma analítica permite a qualificação dos EVs presentes em amostras biológicas de forma livre de rótulo e sem qualquer necessidade de etapas pré-analíticas. Este trabalho mostra que a combinação de técnicas poderosas, auxiliadas por uma metodologia altamente rigorosa na preparação de substratos e aquisição de dados, torna a análise de EV profunda, definitiva e robusta.
O princípio da abordagem proposta é preparar um substrato de ouro, adsorver/enxertar ou capturar os subtipos de EV e digitalizá-los por AFM para estimar o tamanho e a morfologia de cada subconjunto de EV. Além disso, esses EVs adsorvidos são analisados por espectroscopia Raman. Esse substrato pode, de fato, apresentar três tipos de interfaces de complexidade crescente: microarrays nus, quimicamente funcionalizados ou ligantes. Antes de descrever as diferentes etapas do protocolo, os leitores são encaminhados para a apresentação esquemática da abordagem da plataforma nanobioanalítica (NBA) na Figura 1, combinando ressonância plasmônica de superfície (SPRi), AFM e espectroscopia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> Figura 1: A plataforma NanoBioAnalítica. A abordagem combina (A) ressonância plasmônica de superfície, (B) microscopia de força atômica e (nano)espectroscopia de infravermelho/Raman, todos engajados no mesmo substrato - um chip de ouro multiplexado. Abreviaturas: NBA = plataforma NanoBioAnalítica; SPRi = ressonância plasmônica de superfície; AFM = microscopia de força atômica; EV = vesícula extracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O biochip de ouro principal constitui o coração da plataforma, uma vez que todas as técnicas de caracterização sem rótulo são conduzidas neste biochip. De acordo com as necessidades de caracterização do EV (global/total de EVs ou subconjuntos de EV) e as limitações/demandas dos métodos utilizados, três tipos de superfícies de biochip de ouro foram desenvolvidas: ou "nuas", quimicamente funcionalizadas "C11/C16", ou ligantes-biofuncionalizadas, chamadas de superfície de ouro "ligante".
O biochip nu, chamado de "nu", permite a simples adsorção de EVs em ouro. É possível selecionar o tampão utilizado e realizar essa adsorção de forma passiva (etapas de incubação e depois enxágue) ou monitorá-lo sob fluxo (em SPRi). Além disso, essa adsorção passiva pode ser realizada em todo o chip (como um macroarray) ou localizada em microarrays usando um spotter de micropipeta. O "procedimento sob fluxo" permite que os investigadores acompanhem a cinética e o nível de adsorção do EV. Essa abordagem no substrato de ouro nu é adotada quando a interface da camada química pode interferir no método analítico (por exemplo, para espectroscopia Raman).
O biochip quimicamente funcionalizado, chamado "C11/C16", é usado para criar um "tapete" denso e robusto de EVs covalentemente ligados na superfície do ouro, formando ligações amidas primárias com os tiolatos quando o objetivo é ter uma visão global da amostra de EV. De fato, neste caso, o ouro é funcionalizado por uma mistura de tiolato de mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") e ácido mercapto-1-hexadecanóico (16-MHA: "C16"), e uma fração dos tiolatos é quimicamente ativada para estabelecer ligação covalente com os alvos. Novamente, essa estratégia pode ser realizada passivamente (etapas de incubação e depois enxágue, seja em "macroarray" ou em vários microarrays usando um observador de micropipetas) ou sob taxas de fluxo (em SPRi) para seguir a cinética e o nível de enxerto de EV na superfície de ouro.
O biochip biofuncionalizado por ligante, chamado de "ligantes", é quimicamente ativado para enxertar covalentemente diferentes ligantes (por exemplo, anticorpos, receptores) para capturar seletivamente (com afinidade) diferentes subconjuntos de EV que coexistem na amostra biológica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD41a antibody</td>
			<td>Diaclone SAS (France)</td>
			<td>447528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP920</td>
			<td>Microparticles GmbH, Germany</td>
			<td>448303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXR3xi&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs derived from platelet concentrates</td>
			<td>Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs from bovine milk</td>
			<td>Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion&#160;</td>
			<td></td>
			<td>853.223.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetron sputtering</td>
			<td>PLASSYS</td>
			<td>SAB5300165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercapto-1-hexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercapto-1-undecanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountains SPIP ones</td>
			<td>Digital Surf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWizard 3 Bioscience&#160;</td>
			<td>Bruker-JPK&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside (OG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumine antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Albumin Serum (RSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-Biacore 3000</td>
			<td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Biochip</td>
			<td>MIMENTO technology platform</td>
			<td></td>
			<td>The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Plex II</td>
			<td>Horiba Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets

As vesículas extracelulares (EVs) são minúsculas vesículas derivadas de membrana produzidas por todas as células que variam de 50 a várias centenas de nanômetros de diâmetro e são usadas como meio de comunicação intercelular. Eles estão emergindo como ferramentas diagnósticas e terapêuticas promissoras para uma variedade de doenças. Existem dois processos principais de biogênese usados pelas células para produzir EVs com diferenças de tamanho, composição e conteúdo. Devido à sua alta complexidade em tamanho, composição e origem celular, sua caracterização requer uma combinação de técnicas analíticas. Este projeto envolve o desenvolvimento de uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subpopulações de VEs. Para atingir esse objetivo, o trabalho parte da plataforma nanobioanalítica (NBA) estabelecida pelo grupo, que permite uma investigação original de EVs com base em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexados com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica (AFM) de alvos vesiculares presos em um biochip de microarray. O objetivo foi completar esta investigação de EV com uma análise fenotípica e molecular por espectroscopia Raman. Esses desenvolvimentos permitem a proposta de uma solução analítica multimodal e fácil de usar para a discriminação de subconjuntos de EV em fluidos biológicos com potencial clínico

Determinação das condições ótimas de pH para enxerto de ligantes Os diferentes ligantes utilizados para o preparo dos biochips são testados em função do pH e de sua disponibilidade para interagir com a camada química tiolato (Figura 3). Os ligantes são diluídos em tampão acetato em diferentes valores de pH e injetados no biochip quimicamente funcionalizado com uma camada C11C16. As soluções são injetadas aleatoriamente na superfície e um detergente (OG a 4...

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Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Este trabalho propõe uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subconjuntos de vesículas extracelulares. O método é baseado em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexado com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica, juntamente com espectroscopia Raman, para qualificar alvos vesiculares presos em um biochip de microarray.

Plataforma Analítica Multimodal em um Chip de Ressonância de Plasmon de Superfície Multiplexada para a Análise de Subconjuntos de Vesículas Extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

A natureza complexa dos EVs dificulta o reconhecimento da subpopulação de interesse, e esse protocolo pode detectá-los com seu fenótipo, perfil de tamanho e propriedades nanomecânicas. Esta combinação de técnica é um método livre de rótulos, que nos permite detectar EVs em tempo real a partir do meio da condição e do plasma sanguíneo. Esta técnica permite caracterizar profundamente o subconjunto de nanopartículas de interesse, a fim de serem utilizadas como bioindicadores de patologia, ou também utilizadas como nanopartículas para a entrega de fármacos.Uma vez que é um método muito sensível, é imperativo prestar atenção à preparação do biochip antes de injetar sua amostra de interesse. Após o revestimento e funcionalização dos chips, incubar o biochip em uma mistura de 200 milimolares de etildimetilaminopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida e 50 milimolares por litro de N-hidroxisuccinimida por pelo menos 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. Usando o spotter, adicione 300 nanolitros de solução de ligante e incube o biochip sob um banho sônico por 30 minutos.Lave o biochip de cima com água ultrapura. Adicione uma gota de óleo com o mesmo índice de refração que o prisma para criar uma camada fina uniforme entre o biochip e o prisma, e coloque-a suavemente em um prisma com o mesmo índice de refração que o biochip. Para imagens de ressonância plasmônica de superfície, monte o biochip no sistema SPRi.Navegue até o menu suspenso no lado esquerdo do software e clique no Diretório de trabalho. Encontre a imagem onde diferentes pontos são visíveis e clique para selecionar essa imagem. Em seguida, escreva o nome das famílias de ligantes e clique na definição de espécies de acabamento.Arraste a linha preta com o cursor para o ângulo de trabalho ideal. Clique em Mover espelho para o ângulo de trabalho e selecione um ângulo de trabalho. Agora clique em Cinética.À medida que o software solicita que o usuário defina o controle negativo, escolha Sem controle negativo neste momento. Injete albumina sérica de rato a 50 microlitros por minuto durante quatro minutos. Injete etanolamina a 20 microlitros por minuto durante 10 minutos para desativar os grupos carboxílicos ainda presentes e reativos na superfície.Depois, lave o biochip injetando 40 milimolares OG a 50 microlitros por minuto durante quatro minutos. Injete as vesículas extracelulares em uma concentração específica no chip biofuncionalizado enquanto segue a cinética da interação das vesículas nos diferentes pontos, simultaneamente. Determine também o valor da refletividade e o nível de interação.Uma vez estabilizado, injete glutaraldeído no chip para fixar as vesículas extracelulares no local em que estão antes de fazer imagens de AFM. Alinhe o biochip na parte superior da máscara na lâmina de vidro. Use a câmera CCD na parte superior do AFM para localizar o cantilever no local correto que deve ser escaneado.Inicie a aquisição do AFM no modo de contato de três a cinco áreas grandes a pequenas. Em seguida, trate as imagens AFM com o software de processamento de dados JPK selecionando primeiro o canal de altura. Escolha um ajuste polinomial a ser subtraído de cada linha para obter linhas de varredura endireitadas.Selecione o limite de altura nos grãos de ouro para eliminar a rugosidade na superfície. O módulo de extração de grãos marca os grãos usando um limiar de altura de 8,5 nanômetros. Biochips multiplexados foram analisados após passivação de albumina.O chip sem padrão. O chip com alguns defeitos, devido à fusão de manchas, enxerto fraco, ou bolhas ou contaminantes. E um chip de ouro nu sem microarrays para examinar a adsorção de vesículas extracelulares em ouro é mostrado.O experimento de captura em um biochip multiplexado mostrou bons sinais de refletividade para diferentes ligantes e uma boa relação sinal-ruído para os diferentes ligantes, uma vez que a resposta do controle negativo foi insignificante. A adsorção extracelular da vesícula após a injeção da amostra de vesícula extracelular apresentou alto sinal de refletividade, sugerindo que essas vesículas foram capazes de adsorver e permanecer estáveis no chip de ouro. Após o carregamento da vesícula extracelular, foram geradas as imagens AFM em larga e pequena escala de vesículas extracelulares em biochips.Uma visão mais próxima de alta resolução permite a metrologia de vesículas extracelulares. O diâmetro efetivo das vesículas extracelulares em um biochip variou de 30 a 300 nanômetros, com grande maioria em torno de 60 nanômetros. Os resultados obtidos em ar e líquido foram comparáveis.O espectro Raman das vesículas extracelulares adsorvidas em um chip nu revelou um espectro claro, com picos correspondendo principalmente às vibrações de metileno, que estão associadas aos lipídios das membranas das vesículas extracelulares. É importante preparar seu biochip rigorosamente para poder detectar seus EVs com precisão e de forma reprodutível. Métodos convencionais como Western blotting e análise de rastreamento de nanopartículas podem ser utilizados para correlacionar e confirmar fenótipos e padrões de tamanho.Além disso, as análises multi-ômicas são previstas para se aprofundar ainda mais na caracterização molecular de EV e na potencial discriminação de subconjuntos.

Research

JoVE Journal

Biology

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Biologia

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Imagem On-chip sem lente de Células fornece uma nova ferramenta de alta capacidade: Biologia Celular e Diagnóstico Médico

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidez baseado Triagem Interação Extracelular (AVEXIS) para a detecção escalável de baixa afinidade Extracelular receptor-ligante Interações

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Enriquecimento de Proteínas da Matriz Extracelular a partir de tecidos e digestão em péptidos para Análise de Espectrometria de Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...