Name: multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Келли Обертен (Kelly Aubertin) и Фабьен Пико (Fabien Picot) из основного центра IVETh (Париж) получили признание за эксперименты по рамановской визуализации. Тьерри Бурнуф (Тайбэйский медицинский университет, Тайвань) и Зузана Крупова (из Хелинкура, Франция) получили признание за предоставление образцов EV, полученных из образцов тромбоцитов крови и бычьего молока соответственно. Работа была поддержана регионом Бургундия Франш-Конте и аспирантурой EUR EIPHI (проект NOVICE, 2021-2024). Часть этой работы была выполнена с использованием платформы CLIPP и в чистых помещениях RENATECH в FEMTO-ENGINEERING, за что мы благодарим Рабаха Зеггари.

1. Подготовка золотого субстрата
ПРИМЕЧАНИЕ: На золотой крошке производятся три типа поверхностей: 1) голая поверхность, 2) химически функционализированная и 3) биофункционализированная (лиганды, привитые к слою C11C16). С этого момента они будут называться «голым...

<ol>
	<li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products:+A+position+paper+of+the+group+&amp;#34;Extracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France&amp;#34;.">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &amp;#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&amp;#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).</li><li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes.">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li><li>Hartjes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+vesicles+as+emerging+theranostic+nanoplatforms.">Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms.</a> Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).</li><li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations.">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).</li><li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Definition,+isolation+and+characterization.">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li><li>Brisson, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+activated+platelets:+A+semiquantitative+cryo-electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+study.">Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study.</a> Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+A+novel+approach+to+the+detection+of+nanosized+blood+microparticles.">Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).</li><li>Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., P&#233;try, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensional+characterization+of+extracellular+vesicles+using+atomic+force+microscopy.">Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy.</a> Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).</li><li>Beekman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-capture+of+extracellular+vesicles+for+individual+multi-modal+characterization+using+AFM,+SEM+and+Raman+spectroscopy.">Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy.</a> Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).</li><li>Malenica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+microscopy+methods+for+morphology+characterisation+of+extracellular+vesicles+from+human+biofluids.">Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids.</a> Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo.">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion:+A+tool+to+improve+transfusion+safety.">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+&#171;on-chip&#187;+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles.">Development of a NanoBioAnalytical platform for &#171;on-chip&#187; qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li><li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles.">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li><li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis.">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).</li><li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM:+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM.">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).</li><li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicle+(EV)+Array:+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping.">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).</li><li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+(SUPRA-MS):+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma.">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li><li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+lipids:+A+review.">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li><li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers.">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li><li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing.">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li><li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging.">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246 (2016).</li><li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles.">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li></ol>

Наиболее широко используемыми методами идентификации ВВ являются белково-специфический иммуноблоттинг для подтверждения происхождения ВВ, ПЭМ для подтверждения их структуры и НТА для количественной оценки их количества и распределения по размерам в объемеобразца 3. Тем...

Растущий интерес к исследованиям электромобилей в диагностике и терапии 1,2,3,4,5 в сочетании с проблемами, с которыми сталкивается эта область, привел к разработке и внедрению большого разнообразия подходов и методов для количественной оценки или характеристики этих везикул. Наиболее широко используемыми методами идентификации EV являются белково-специфический иммуноблоттинг и протеомика для подтверждения происхождения EV, просвечивающая электронная микроскопия (TEM) для подтверждения их структуры и анализ отслеживания наночастиц (NTA) для количественной оценки их количества и распределения по размерам в объеме образца.
Однако ни один из этих методов сам по себе не дает всей информации, необходимой для характеристики подмножеств электромобилей. Присущая электромобилям гетерогенность из-за разнообразия их биохимических и физических свойств препятствует глобальному анализу, который является надежным и воспроизводимым, особенно для электромобилей, содержащихся в смеси (сыром образце). Таким образом, методы обнаружения и определения характеристик необходимы для электромобилей, как индивидуально, так и в целом, чтобы дополнить другие методы, которые являются более быстрыми, но не селективными6.
Визуализация с высоким разрешением с помощью ПЭМ (или криоТЕМ) или АСМ позволяет определять морфологию и метрологию электромобилей с нанометровым разрешением 7,8,9,10,11,12. Однако основным ограничением использования электронной микроскопии для биологических объектов, таких как EV, является необходимость вакуума для проведения исследования, которое требует фиксации и обезвоживания образца. Такая подготовка затрудняет перевод от наблюдаемых структур к морфологии EV в растворе. Чтобы избежать такого обезвоживания образца, метод криоТЭМ является наиболее подходящим для характеристики ЭВ13. Он широко используется для определения ультраструктуры электромобилей. Иммуномаркировка везикул биофункционализированными наночастицами золота также позволяет идентифицировать специфические субпопуляции ЭВ и отличать их от других частиц, присутствующих в сложном биологическом образце. Однако из-за небольшого количества электромобилей, анализируемых с помощью электронной микроскопии, часто бывает трудно выполнить характеристику, репрезентативную для сложного и неоднородного образца.
Чтобы выявить эту гетерогенность размеров, Международное общество внеклеточных везикул (ISEV) предлагает проанализировать достаточное количество широкопольных изображений, сопровождаемых изображениями меньшего размера, чтобы выявить отдельные EV с высоким разрешением14. АСМ является альтернативой оптическим подходам и электронным дифракционным методам для исследования электромобилей. В этом методе используется острый наконечник, удерживаемый гибким консолью, который сканирует образец, нанесенный на одну опору, строка за линией, и регулирует расстояние между наконечником и присутствующими элементами через петлю обратной связи. Это позволяет охарактеризовать топографию образца и собрать морфомеханическую информацию15,16,17,18. EV могут быть отсканированы с помощью AFM либо после осаждения на атомарно плоской подложке, либо после захвата на специфический субстрат, функционализированный антителами, пептидами или аптамерами, для характеристики различных субпопуляций18,19. Благодаря своей способности количественно определять и одновременно исследовать структуру, биомеханику и мембранное биомолекулярное содержание электромобилей в сложных биологических образцах без необходимости предварительной обработки, маркировки или обезвоживания, АСМ в настоящее время все чаще используется для точной и многопараметрической характеристики электромобилей в физиологических условиях температуры и среды.
В данной работе предложена методология с использованием основного золотого биочипа, способного к (био)химической функционализации в мультиплексированном формате. Этот субстрат является краеугольным камнем мощной аналитической платформы, объединяющей биообнаружение подмножеств EV с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и после того, как EV адсорбированы / привиты или иммунозахвачены на чипе, AFM позволяет метрологические и морфомеханические характеристики EV. В сочетании с рамановской сигнатурой подмножеств EV, захваченных на чипе, эта аналитическая платформа позволяет квалифицировать EV, присутствующие в биологических образцах, без меток и без необходимости в преаналитических этапах. В этой статье показано, что сочетание мощных методов, подкрепленных очень строгой методологией подготовки субстрата и сбора данных, делает анализ EV глубоким, окончательным и надежным.
Принцип предлагаемого подхода заключается в приготовлении золотого субстрата, адсорбции/трансплантации или захвате подтипов EV и сканировании их с помощью AFM для оценки размера и морфологии каждого подмножества EV. Кроме того, эти адсорбированные электромобили анализируются с помощью рамановской спектроскопии. Этот субстрат действительно может представлять три типа интерфейсов растущей сложности: голые, химически функционализированные или лигандные микрочипы. Прежде чем описывать различные этапы протокола, читатели могут обратиться к схематическому представлению подхода нанобиоаналитической платформы (NBA) на рисунке 1, сочетающего поверхностную плазмонно-резонансную томографию (SPRi), АСМ и спектроскопию.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Платформа NanoBioAnalytical. Этот подход сочетает в себе (A) поверхностно-плазмонно-резонансную томографию, (B) атомно-силовую микроскопию и инфракрасную/рамановскую (нано)спектроскопию, которые выполняются на одной и той же подложке - мультиплексированном золотом чипе. Сокращения: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = поверхностно-плазмонно-резонансная томография; АСМ = атомно-силовая микроскопия; EV = внеклеточный везикула. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Основной золотой биочип является сердцем платформы, поскольку на этом биочипе проводятся все методы определения характеристик без меток. В соответствии с потребностями характеристики EV (либо глобальные/общие EV, либо подмножества EV) и ограничениями/требованиями используемых методов, были разработаны три типа поверхностей золотых биочипов: либо «голые», химически функционализированные «C11/C16», либо лигандно-биофункционализированные, называемые «лигандной» золотой поверхностью.
 Голый биочип, называемый «голым», обеспечивает простую адсорбцию электромобилей на золоте. Можно выбрать используемый буфер и реализовать эту адсорбцию либо пассивным способом (этапы инкубации и последующей промывки), либо контролировать его под потоком (в SPRi). Более того, эта пассивная адсорбция может быть реализована либо на всем чипе (в виде макрочипа), либо локализована в микрочипах с помощью микропипетки-споттера. «Процедура под потоком» позволяет исследователям следить за кинетикой и уровнем адсорбции EV. Этот подход на голой золотой подложке применяется, когда граница раздела химического слоя может мешать аналитическому методу (например, для рамановской спектроскопии).
 Химически функционализированный биочип, называемый «C11 / C16», используется для создания плотного и прочного «ковра» из EV, ковалентно связанных на поверхности золота, путем образования первичных амидных связей с тиолатами, когда цель состоит в том, чтобы иметь глобальное представление об образце EV. Действительно, в этом случае золото функционализируется тиолатной смесью меркапто-1-ундеканола (11-MUOH: «C11») и меркапто-1-гексадекановой кислоты (16-MHA: «C16»), а часть тиолатов химически активируется для установления ковалентного связывания с мишенями. Опять же, эта стратегия может быть реализована либо пассивно (этапы инкубации, а затем промывки, либо в «макромассиве», либо в нескольких микрочипах с использованием микропипетки-споттера), либо при низких скоростях потока (в SPRi), чтобы следить за кинетикой и уровнем прививки EV на поверхности золота.
 Лиганд-биофункционализированный биочип, называемый «лигандами», химически активируется для ковалентного трансплантата различных лигандов (например, антител, рецепторов) для селективного захвата (с аффинностью) различных подмножеств EV, которые сосуществуют в биологическом образце.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD41a antibody</td>
			<td>Diaclone SAS (France)</td>
			<td>447528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP920</td>
			<td>Microparticles GmbH, Germany</td>
			<td>448303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXR3xi&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs derived from platelet concentrates</td>
			<td>Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs from bovine milk</td>
			<td>Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion&#160;</td>
			<td></td>
			<td>853.223.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetron sputtering</td>
			<td>PLASSYS</td>
			<td>SAB5300165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercapto-1-hexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercapto-1-undecanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountains SPIP ones</td>
			<td>Digital Surf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWizard 3 Bioscience&#160;</td>
			<td>Bruker-JPK&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside (OG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumine antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Albumin Serum (RSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-Biacore 3000</td>
			<td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Biochip</td>
			<td>MIMENTO technology platform</td>
			<td></td>
			<td>The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Plex II</td>
			<td>Horiba Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой мембранные, крошечные везикулы, продуцируемые всеми клетками, которые варьируются от 50 до нескольких сотен нанометров в диаметре и используются в качестве средства межклеточной коммуникации. Они становятся многообещающими диагностическими и терапевтическими инструментами для лечения различных заболеваний. Существует два основных процесса биогенеза, используемых клетками для производства EV с различиями в размере, составе и содержании. Из-за их высокой сложности по размеру, составу и происхождению клеток их характеристика требует сочетания аналитических методов. Данный проект предполагает разработку нового поколения многопараметрических аналитических платформ с повышенной пропускной способностью для характеризации субпопуляций электромобилей. Для достижения этой цели работа начинается с созданной группой нанобиоаналитической платформы (NBA), которая позволяет проводить оригинальные исследования электромобилей на основе комбинации мультиплексных методов биозондирования с метрологическим и морфомеханическим анализом методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) везикулярных мишеней, захваченных на микрочипе. Цель состояла в том, чтобы завершить это исследование EV фенотипическим и молекулярным анализом с помощью рамановской спектроскопии. Эти разработки позволяют предложить мультимодальное и простое в использовании аналитическое решение для дискриминации подмножеств EV в биологических жидкостях с клиническим потенциалом

Определение оптимальных условий рН для прививки лиганда Различные лиганды, используемые для приготовления биочипов, тестируются в зависимости от рН и их готовности взаимодействовать с химическим слоем тиолата (рис. 3). Лиганды разбавляют в ацетатном буфере п...

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

В данной работе предлагается новое поколение многопараметрических аналитических платформ с повышенной пропускной способностью для характеристики подмножеств внеклеточных везикул. Метод основан на сочетании мультиплексных методов биозондирования с метрологическим и морфомеханическим анализом методом атомно-силовой микроскопии в сочетании с рамановской спектроскопией для квалификации везикулярных мишеней, захваченных на микрочипе.

Мультимодальная аналитическая платформа на мультиплексированном чипе поверхностной плазмонно-резонансной томографии для анализа подмножеств внеклеточных везикул

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Сложная природа электромобилей затрудняет распознавание интересующей субпопуляции, и этот протокол может обнаруживать их по фенотипу, размерному профилю и наномеханическим свойствам. Эта комбинация методов представляет собой метод без меток, который позволяет нам обнаруживать EV в режиме реального времени из среды состояния и плазмы крови. Этот метод позволяет охарактеризовать глубоко подмножество наночастиц, представляющих интерес, для использования в качестве биоиндикаторов патологии или также в качестве наночастиц для доставки лекарств.Поскольку это очень чувствительный метод, крайне важно обратить внимание на препарат биочипа, прежде чем вводить интересующий вас образец. После покрытия и функционализации чипов биочип инкубируют в смеси 200-миллимолярного этилдиметиламинопропилкарбодиимида/N-гидроксисукцинимида и 50 миллимоляров на литр N-гидроксисукцинимида в течение не менее 30 минут в темноте при комнатной температуре. С помощью споттера добавьте 300 нанолитров раствора лиганда и инкубируйте биочип под звуковой ванной в течение 30 минут.Промойте биочип сверху сверхчистой водой. Добавьте каплю масла с тем же показателем преломления, что и призма, чтобы создать однородный тонкий слой между биочипом и призмой, и аккуратно поместите ее на призму с тем же показателем преломления, что и биочип. Для поверхностной плазмонно-резонансной томографии установите биочип на систему SPRi.Перейдите в раскрывающееся меню в левой части программного обеспечения и нажмите «Рабочий каталог». Найдите изображение, на котором видны разные пятна, и нажмите, чтобы выбрать это изображение. Затем напишите название семейств лигандов и нажмите на определение вида Finish.Перетащите черную линию курсором на оптимальный рабочий угол. Нажмите «Переместить зеркало на рабочий угол» и выберите рабочий угол. Теперь нажмите на Кинетику.Когда программное обеспечение предложит пользователю определить отрицательный элемент управления, выберите «Без отрицательного элемента управления» на этом этапе. Вводите сывороточный альбумин крысы со скоростью 50 микролитров в минуту в течение четырех минут. Вводите этаноламин со скоростью 20 микролитров в минуту в течение 10 минут, чтобы дезактивировать карбоксильные группы, все еще присутствующие и реагирующие на поверхности.После этого промойте биочип, вводя 40 миллимолярных OG со скоростью 50 микролитров в минуту в течение четырех минут. Вводят внеклеточные везикулы в определенной концентрации на биофункционализированном чипе, одновременно следя за кинетикой взаимодействия везикул в разных точках. Также определите значение отражательной способности и уровень взаимодействия.После стабилизации введите глутаровый альдегид в чип, чтобы зафиксировать внеклеточные везикулы в том месте, где они находятся, прежде чем делать АСМ-томографию. Выровняйте биочип в верхней части маски на предметном стекле. Используйте ПЗС-камеру в верхней части АСМ, чтобы локализовать консоль в нужном месте, которое необходимо сканировать.Запускайте сбор АСМ в контактном режиме с трех-пяти больших до малых участков. Затем обработайте изображения АСМ с помощью программного обеспечения для обработки данных JPK, сначала выбрав канал высоты. Выберите полиномиальную подгонку, которую нужно вычесть из каждой строки, чтобы получить выпрямленные линии развертки.Выберите порог высоты на золотых зернах, чтобы устранить шероховатости на поверхности. Модуль экстракции зерна маркирует зерна с помощью порога высоты 8,5 нанометров. Мультиплексные биочипы анализировали после пассивации альбумина.Чип без дефолта. Скол с некоторыми дефектами, обусловленными слиянием пятен, слабой прививкой, пузырьками или загрязнениями. И показан голый золотой чип без микрочипов для исследования адсорбции внеклеточных везикул на золоте.Эксперимент по захвату на мультиплексированном биочипе показал хорошие сигналы отражательной способности для разных лигандов и хорошее отношение сигнал/шум для разных лигандов, поскольку отклик отрицательного контроля был незначительным. Адсорбция внеклеточных везикул после инъекции образца внеклеточных везикул показала высокий сигнал отражательной способности, что позволяет предположить, что эти везикулы способны адсорбироваться и оставаться стабильными на золотом чипе. После загрузки внеклеточных везикул были получены крупномасштабные и мелкомасштабные АСМ-изображения внеклеточных везикул на биочипах.Более близкий обзор с высоким разрешением позволяет проводить метрологию внеклеточных везикул. Эффективный диаметр внеклеточных везикул на биочипе варьировался от 30 до 300 нанометров, причем подавляющее большинство составляло около 60 нанометров. Результаты, полученные на воздухе и в жидкости, были сопоставимы.Рамановский спектр внеклеточных везикул, адсорбированных на голом чипе, выявил четкий спектр с пиками, соответствующими в основном метиленовым колебаниям, которые связаны с липидами мембран внеклеточных везикул. Важно тщательно подготовить свой биочип, чтобы иметь возможность точно и воспроизводимо обнаруживать ваши электромобили. Традиционные методы, такие как вестерн-блоттинг и анализ отслеживания наночастиц, могут быть задействованы для корреляции и подтверждения фенотипов и моделей размеров.Кроме того, предполагается, что мультиомный анализ еще глубже углубится в молекулярную характеристику EV и потенциальную дискриминацию подмножеств.

Research

JoVE Journal

Biology

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Безлинзовой на кристалле изображений клеток обеспечивает новый инструмент для высокой пропускной Cell-биологии и медицинской диагностики

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Электронного парамагнитного резонанса Микро-изображения живых видов карт для использования с кислородом

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Алчность на основе взаимодействия внеклеточной скрининга (AVEXIS) для масштабируемых обнаружения низкого сродства внеклеточного рецептор-лиганд

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

гДНК Обогащение на транспозазу основе технологии для NGS Анализ всей последовательности<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, и 9 генов, вовлеченных в ДНК Нанесенный Ремонт

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Измерение и анализ внеклеточной кислоты производства, чтобы определить гликолитических Оценить

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Анализ отслеживания наночастиц для количественной оценки и определения размера внеклеточных везикул

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...