Name: multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Kelly Aubertin och Fabien Picot från IVETh-kärnanläggningen (Paris) uppmärksammas för Raman-avbildningsexperimenten. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) och Zuzana Krupova (från Helincourt, Frankrike) är erkända för att ha tillhandahållit EV-prover från blodplättar respektive nötkreatursmjölkprover. Arbetet stöddes av regionen Bourgogne Franche-Comté och forskarskolan EUR EIPHI (NOVIS-projektet, 2021–2024). En del av detta arbete gjordes med hjälp av CLIPP-plattformen och i RENATECHs renrumsanläggningar i FEMTO-ENGINEERING, vilket vi tackar Rabah Zeggari för.

1. Förberedelse av guldsubstrat
OBS: Tre typer av ytor produceras på guldflis: 1) naken yta, 2) kemiskt funktionaliserad och 3) biofunktionaliserad (ligander ympade på C11C16-skikt). De kommer att kallas "nakna", "C11C16" respektive "ligander" från och med nu.
<ol><li>Förberedelse av guldsubstrat: OBS: För detta protokoll tillverkades guldbiochipsen internt i renrummet. De hemmagjorda biochipsen bestod av glasskivor...

<ol>
	<li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products:+A+position+paper+of+the+group+&amp;#34;Extracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France&amp;#34;.">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &amp;#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&amp;#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).</li><li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes.">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li><li>Hartjes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+vesicles+as+emerging+theranostic+nanoplatforms.">Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms.</a> Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).</li><li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations.">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).</li><li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Definition,+isolation+and+characterization.">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li><li>Brisson, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+activated+platelets:+A+semiquantitative+cryo-electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+study.">Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study.</a> Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+A+novel+approach+to+the+detection+of+nanosized+blood+microparticles.">Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).</li><li>Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., P&#233;try, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensional+characterization+of+extracellular+vesicles+using+atomic+force+microscopy.">Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy.</a> Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).</li><li>Beekman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-capture+of+extracellular+vesicles+for+individual+multi-modal+characterization+using+AFM,+SEM+and+Raman+spectroscopy.">Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy.</a> Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).</li><li>Malenica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+microscopy+methods+for+morphology+characterisation+of+extracellular+vesicles+from+human+biofluids.">Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids.</a> Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo.">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion:+A+tool+to+improve+transfusion+safety.">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).</li><li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+&#171;on-chip&#187;+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles.">Development of a NanoBioAnalytical platform for &#171;on-chip&#187; qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li><li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles.">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li><li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis.">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).</li><li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM:+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM.">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).</li><li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicle+(EV)+Array:+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping.">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).</li><li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+(SUPRA-MS):+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma.">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li><li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+lipids:+A+review.">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li><li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers.">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li><li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing.">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li><li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging.">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246 (2016).</li><li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles.">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li></ol>

De senaste metoderna för EV-identifiering som är de mest använda är proteinspecifik immunoblot för att bekräfta ursprunget till EV, TEM för att bekräfta deras struktur och NTA för att kvantifiera deras antal och storleksfördelning i en provvolym3. Ändå har det stora intresset för EV i (bio) medicinsk forskning och begränsningarna i befintliga analysverktyg fått det vetenskapliga samfundet att utveckla nya metoder för EV-karakterisering, diskriminering och kvantifiering.
<p clas...

Det växande intresset för EV-forskning inom diagnostik och terapi 1,2,3,4,5, i kombination med de utmaningar som detta område står inför, har resulterat i utveckling och implementering av en mängd olika metoder och tekniker för att kvantifiera eller karakterisera dessa vesiklar. De mest använda metoderna för EV-identifiering är proteinspecifik immunoblot och proteomik för att bekräfta ursprunget till EV, transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att bekräfta deras struktur och nanopartikelspårningsanalys (NTA) för att kvantifiera deras antal och storleksfördelning i en provvolym.
Ingen av dessa tekniker på egen hand ger dock all information som krävs för att karakterisera EV-delmängder. Den inneboende heterogeniteten hos elfordon på grund av mångfalden i deras biokemiska och fysikaliska egenskaper hindrar globala analyser som är tillförlitliga och reproducerbara, särskilt för elfordon som ingår i en blandning (råprov). Detektions- och karakteriseringsmetoder behövs därför för elfordon, både individuellt och generellt för att komplettera andra metoder som är snabbare men inte selektiva6.
Högupplöst avbildning med TEM (eller kryoTEM) eller AFM gör det möjligt att bestämma morfologin och metrologin hos elfordon med nanometrisk upplösning 7,8,9,10,11,12. Den huvudsakliga begränsningen av användningen av elektronmikroskopi för biologiska föremål, såsom EV, är emellertid behovet av ett vakuum för att genomföra studien som kräver fixering och uttorkning av provet. Sådan beredning gör det svårt att översätta från de observerade strukturerna till EV-morfologin i lösningen. För att undvika denna uttorkning av provet är tekniken för kryoTEM den mest lämpliga för EV-karakterisering13. Det används ofta för att bestämma ultrastrukturen hos elbilar. Immunmärkning av vesiklar med biofunktionaliserade guldnanopartiklar gör det också möjligt att identifiera specifika subpopulationer av EV och skilja dem från andra partiklar som finns i ett komplext biologiskt prov. På grund av det låga antalet EV som analyseras med elektronisk mikroskopi är det emellertid ofta svårt att utföra en karakterisering som är representativ för ett komplext och heterogent prov.
För att avslöja denna storleksheterogenitet föreslår International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) att man analyserar ett tillräckligt antal widefield-bilder, åtföljda av mindre bilder, för att avslöja enskilda elbilar med hög upplösning14. AFM är ett alternativ till optiska metoder och elektroniska diffraktionstekniker för studier av EV. Denna teknik använder en skarp spets som hålls av en flexibel utskjutare som skannar provet deponerat på ett stöd, rad för rad, och justerar avståndet mellan spetsen och elementen som finns genom en återkopplingsslinga. Detta gör det möjligt att karakterisera provets topografi och samla in morfomekanisk information15,16,17,18. EV: erna kan skannas av AFM antingen efter att ha deponerats på ett atomiskt plant substrat eller efter att ha fångats på ett specifikt substrat funktionaliserat av antikroppar, peptider eller aptamerer för att karakterisera de olika subpopulationerna18,19. På grund av dess förmåga att kvantifiera och samtidigt undersöka strukturen, biomekaniken och det membranösa biomolekylära innehållet i EV inom komplexa biologiska prover utan behov av förbehandling, märkning eller uttorkning, används AFM nu alltmer för att karakterisera EV på ett fint och multiparametriskt sätt under fysiologiska temperatur- och mediumförhållanden.
Detta dokument föreslår en metod som använder ett kärnguldbiochip som kan (bio) kemiskt funktionaliseras i ett multiplexerat format. Detta substrat är hörnstenen i en kraftfull analytisk plattform som kombinerar biodetektion av EV-delmängder genom ytplasmonresonans, och när EV: erna är adsorberade / ympade eller immunfångade på chipet möjliggör AFM den metrologiska och morfomekaniska karakteriseringen av EV: erna. Tillsammans med Raman-signaturen för EV-delmängderna som fångats på chipet, möjliggör denna analytiska plattform kvalificering av EV: er som finns i biologiska prover på ett etikettfritt sätt och utan behov av föranalytiska steg. Detta dokument visar att kombinationen av kraftfulla tekniker, med hjälp av en mycket rigorös metod för substratberedning och datainsamling, gör EV-analysen djup, definitiv och robust.
Principen för det föreslagna tillvägagångssättet är att förbereda ett guldsubstrat, att adsorbera / ympa eller fånga EV-undertyperna och att skanna dem med AFM för att uppskatta storleken och morfologin för varje EV-delmängd. Dessutom analyseras de adsorberade EV: erna med Raman-spektroskopi. Detta substrat kan faktiskt presentera tre typer av gränssnitt av växande komplexitet: nakna, kemiskt funktionaliserade eller ligandmikroarrayer. Innan de olika stegen i protokollet beskrivs hänvisas läsarna till den schematiska presentationen av den nanobioanalytiska plattformen (NBA) -metoden i figur 1, som kombinerar ytplasmonresonansavbildning (SPRi), AFM och spektroskopi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> Figur 1: NanoBioAnalytical plattformen. Tillvägagångssättet kombinerar (A) ytplasmonresonansavbildning, (B) atomkraftmikroskopi och infraröd / Raman (nano) spektroskopi, alla engagerade på samma substrat - ett multiplexerat guldchip. Förkortningar: NBA = NanoBioAnalytical plattform; SPRi = ytplasmonresonansavbildning; AFM = atomkraftmikroskopi; EV = extracellulär vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kärnguldbiochipet utgör plattformens hjärta eftersom alla etikettfria karakteriseringstekniker utförs på detta biochip. Enligt behoven hos EV-karakteriseringen (antingen globala / totala EV eller EV-delmängder) och begränsningarna / kraven på de använda metoderna har tre typer av guldbiochipytor utvecklats: antingen "naken", kemiskt funktionaliserad "C11 / C16" eller ligandbiofunktionaliserad, kallad "ligand" guldyta.
Det nakna biochipet, kallat "naket", möjliggör enkel adsorption av elbilar på guld. Det är möjligt att välja den buffert som används och realisera denna adsorption antingen på ett passivt sätt (inkubation och sedan sköljsteg) eller att övervaka den under flöde (i SPRi). Dessutom kan denna passiva adsorption realiseras antingen på hela chipet (som en makroarray) eller lokaliseras i mikroarrayer med hjälp av en mikropipettspotter. "Underflödesproceduren" gör det möjligt för utredare att följa kinetiken och nivån av EV-adsorption. Detta tillvägagångssätt på det nakna guldsubstratet antas när det kemiska skiktgränssnittet kan störa analysmetoden (t.ex. för Raman-spektroskopi).
Det kemiskt funktionaliserade biochipet, kallat "C11 / C16", används för att skapa en tät och robust "matta" av EV kovalent bundna på guldytan genom att bilda primära amidbindningar med tiolaterna när målet är att få en global bild av EV-provet. I detta fall funktionaliseras guldet faktiskt av en tiolatblandning av merkapto-1-undekanol (11-MUOH: "C11") och merkapto-1-hexadekansyra (16-MHA: "C16"), och en fraktion av tiolaterna aktiveras kemiskt för att upprätta kovalent bindning med målen. Återigen kan denna strategi realiseras antingen passivt (inkubation och sedan sköljsteg, antingen i "makroarray" eller i flera mikroarrayer med hjälp av en mikropipettspotter) eller under flödeshastigheter (i SPRi) för att följa kinetiken och nivån av EV-ympning på guldytan.
Det ligandbiofunktionaliserade biochipet, kallat "ligander", aktiveras kemiskt för att kovalent ympa olika ligander (t.ex. antikroppar, receptorer) för att selektivt fånga (med affinitet) olika EV-undergrupper som samexisterar i det biologiska provet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD41a antibody</td>
			<td>Diaclone SAS (France)</td>
			<td>447528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP920</td>
			<td>Microparticles GmbH, Germany</td>
			<td>448303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DXR3xi&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs derived from platelet concentrates</td>
			<td>Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evs from bovine milk</td>
			<td>Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion&#160;</td>
			<td></td>
			<td>853.223.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetron sputtering</td>
			<td>PLASSYS</td>
			<td>SAB5300165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mercapto-1-hexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercapto-1-undecanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountains SPIP ones</td>
			<td>Digital Surf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWizard 3 Bioscience&#160;</td>
			<td>Bruker-JPK&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside (OG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumine antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Albumin Serum (RSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-Biacore 3000</td>
			<td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Biochip</td>
			<td>MIMENTO technology platform</td>
			<td></td>
			<td>The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRi Plex II</td>
			<td>Horiba Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal analytical platform on a multiplexed surface plasmon resonance imaging chip for the analysis of extracellular vesicle subsets

Extracellulära vesiklar (EV) är membranhärledda, små vesiklar som produceras av alla celler som sträcker sig från 50 till flera hundra nanometer i diameter och används som ett medel för intercellulär kommunikation. De framträder som lovande diagnostiska och terapeutiska verktyg för en mängd olika sjukdomar. Det finns två huvudsakliga biogenesprocesser som används av celler för att producera EV med skillnader i storlek, sammansättning och innehåll. På grund av deras höga komplexitet i storlek, sammansättning och cellursprung kräver deras karakterisering en kombination av analytiska tekniker. Detta projekt omfattar utveckling av en ny generation av multiparametriska analysplattformar med ökad genomströmning för karakterisering av delpopulationer av elbilar. För att uppnå detta mål utgår arbetet från den nanobioanalytiska plattformen (NBA) som inrättats av gruppen, som möjliggör en originalundersökning av EV baserat på en kombination av multiplexerade biosensormetoder med metrologiska och morfomekaniska analyser genom atomkraftmikroskopi (AFM) av vesikulära mål fångade på ett mikroarraybiochip. Målet var att komplettera denna EV-undersökning med en fenotypisk och molekylär analys med Raman-spektroskopi. Denna utveckling möjliggör förslag till en multimodal och lättanvänd analytisk lösning för diskriminering av EV-undergrupper i biologiska vätskor med klinisk potential

Bestämning av optimala pH-förhållanden för ligandtransplantation De olika ligander som används för att bereda biochipen testas som en funktion av pH och deras tillgänglighet att interagera med det tiolata kemiska skiktet (figur 3). Liganderna späds ut i acetatbuffert vid olika pH-värden och injiceras på biochipet kemiskt funktionaliserat med ett C11C16-skikt. Lösningarna injiceras slumpmässigt på ytan och ett rengöringsmedel (OG vid 40 mM) injiceras efter va...

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets at JoVE.com

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Denna artikel föreslår en ny generation av multiparametriska analysplattformar med ökad genomströmning för karakterisering av extracellulära vesikelundergrupper. Metoden är baserad på en kombination av multiplexerade biosensormetoder med metrologiska och morfomekaniska analyser med atomkraftmikroskopi, tillsammans med Ramanspektroskopi, för att kvalificera vesikulära mål fångade på ett mikroarraybiochip.

Multimodal analytisk plattform på ett multiplexerat ytplasmonresonansbildningschip för analys av extracellulära vesikelundergrupper

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

EV: s komplexa natur gör det svårt att känna igen subpopulationen av intresse, och detta protokoll kan upptäcka dem med deras fenotyp, storleksprofil och nanomekaniska egenskaper. Denna kombination av teknik är en etikettfri metod som gör det möjligt för oss att upptäcka elbilar i realtid från tillståndsmediet och blodplasman. Denna teknik gör det möjligt att karakterisera djupt delmängd av nanopartiklar av intresse, för att kunna användas som bioindikatorer för patologi, eller också användas som nanopartikel för läkemedelsleverans.Eftersom det är en mycket känslig metod är det absolut nödvändigt att vara uppmärksam på biochippreparatet innan du injicerar ditt prov av intresse. Efter beläggning och funktionalisering av flisen, inkubera biochipet i en blandning av 200 millimolar etyldimetylaminopropylkarbodiimid/N-hydroxisuccinimid och 50 millimolar per liter N-hydroxisuccinimid i minst 30 minuter i mörker vid rumstemperatur. Använd spottern, tillsätt 300 nanoliter ligandlösning och inkubera biochipet under ett soniskt bad i 30 minuter.Tvätta biochipet från toppen med ultrarent vatten. Tillsätt en droppe olja med samma brytningsindex som prisma för att skapa ett enhetligt tunt skikt mellan biochipet och prisman och placera det försiktigt på ett prisma med samma brytningsindex som biochipet. För ytplasmonresonanstomografi, montera biochipet på SPRi-systemet.Navigera till rullgardinsmenyn till vänster om programvaran och klicka på Arbetskatalogen. Hitta bilden där olika fläckar är synliga och klicka för att välja den här bilden. Skriv sedan namnet på ligandfamiljerna och klicka på definitionen Slutför art.Dra den svarta linjen med markören till optimal arbetsvinkel. Klicka på Flytta spegel till arbetsvinkel och välj en arbetsvinkel. Klicka nu på Kinetics.När programvaran uppmanar användaren att definiera den negativa kontrollen väljer du Ingen negativ kontroll vid denna punkt. Injicera råttserumalbumin vid 50 mikroliter per minut i fyra minuter. Injicera etanolamin med 20 mikroliter per minut i 10 minuter för att inaktivera de karboxylgrupper som fortfarande finns och är reaktiva på ytan.Tvätta sedan biochipet genom att injicera 40 millimolar OG vid 50 mikroliter per minut i fyra minuter. Injicera de extracellulära vesiklarna i en specifik koncentration på det biofunktionaliserade chipet medan du följer kinetiken för interaktionen mellan vesiklar på de olika fläckarna samtidigt. Bestäm också värdet av reflektivitet och interaktionsnivån.När du har stabiliserat, injicera glutaraldehyd på chipet för att fixera extracellulära vesiklar på den plats de är innan du gör AFM-avbildning. Rikta in biochipet på toppen av masken på glasskivan. Använd CCD-kameran ovanpå AFM för att lokalisera utskjutaren på rätt plats som måste skannas.Starta AFM-förvärvet i kontaktläge från tre till fem stora till små områden. Behandla sedan AFM-bilderna med JPK-databehandlingsprogramvara genom att först välja höjdkanalen. Välj en polynompassning som ska subtraheras från varje rad för att få rätade skanningslinjer.Välj höjdtröskeln på guldkorn för att eliminera grovheten på ytan. Kornextraktionsmodulen markerar kornen med en höjdtröskel på 8,5 nanometer. Multiplexerade biochips analyserades efter albuminpassivering.Chipet utan standard. Chipet med vissa defekter, på grund av fusion av fläckar, svag ympning eller bubblor eller föroreningar. Och ett naket guldchip utan mikroarrayer för att undersöka adsorptionen av extracellulära vesiklar på guld visas.Infångningsexperimentet på ett multiplexerat biochip visade goda reflektivitetssignaler för olika ligander och ett bra signal-brusförhållande för de olika liganderna, eftersom svaret från den negativa kontrollen var försumbar. Extracellulär vesikeladsorption efter injektionen av det extracellulära vesikelprovet visade hög reflektivitetssignal, vilket tyder på att dessa vesiklar kunde adsorbera och förbli stabila på guldchipet. Efter extracellulär vesikelbelastning genererades storskaliga och småskaliga AFM-bilder av extracellulära vesiklar på biochips.En högupplöst närbild möjliggör metrologi av extracellulära vesiklar. Den effektiva diametern hos de extracellulära vesiklarna på ett biochip varierade från 30 till 300 nanometer, med en stor majoritet runt 60 nanometer. Resultaten erhållna i luft och vätska var jämförbara.Raman-spektrumet av extracellulära vesiklar adsorberade på ett naket chip avslöjade ett tydligt spektrum, med toppar som huvudsakligen motsvarar metylenvibrationer, vilka är associerade med lipiderna i extracellulära vesikelmembran. Det är viktigt att förbereda ditt biochip noggrant för att kunna upptäcka dina elbilar exakt och på ett reproducerbart sätt. Konventionella metoder som Western blotting och nanopartikelspårningsanalys kan användas för att korrelera och bekräfta fenotyper och storleksmönster.Dessutom är multi-omiska analyser tänkta att till och med gå djupare in i EV-molekylär karakterisering och potentiell delmängdsdiskriminering.

Research

JoVE Journal

Biology

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montering, lastning och Uppriktning av en analytisk ultracentrifugen Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Lensless On-chip Imaging Celler ett nytt verktyg för high-throughput Cell-biologi och medicinsk diagnostik

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomvid Analys med hjälp av chip för att identifiera isoform-specifik gen mål

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Electron Spin Resonance Micro-avbildning av Live Arter för Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Aviditet-baserad Extracellulär Interaktion Screening (AVEXIS) för den skalbara Detektion av låg-affinitets extracellulär receptor-ligand-interaktioner

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Anrikning av ett transposas baserad teknik för NGS Analys av hela sekvensen av<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, och nio gener involverade i DNA-skador Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av extracellulära matrixproteiner från vävnader och matsmältning i peptider för masspektrometri analys

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Mätning och analys av extracellulärt Acid Production att bestämma glykolytisk Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikelspårningsanalys för kvantifiering och storleksbestämning av extracellulära blåsor

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...