Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82002130) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7222059) وصندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (2019-I2M-5-026).

تم الحصول على عينات دم من المرضى الذين يعانون من IM (ن = 3) ، وحاملات EBV الأصحاء (ن = 3) ، والأطفال غير المصابين بفيروس EBV (ن = 3). تم تجنيد متطوعين من مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية ، وتمت الموافقة على جميع الدراسات أخلاقيا. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستش...

<ol>
	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+virology,+and+immunologic+factors+associated+with+acquisition+and+severity+of+primary+Epstein-Barr+virus+infection+in+university+students.">Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).</li><li>Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+mononucleosis.">Infectious mononucleosis.</a> New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan.">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li><li>Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+infection+and+nasopharyngeal+carcinoma.">Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+reveals+major+cell+types+in+the+cellular+immune+response+against+acute+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection.">Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).</li><li>Fedyanina, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+clinical+significance+of+atypical+mononuclear+cells+in+infectious+mononucleosis+caused+by+the+Epstein-Barr+virus+in+children.">The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).</li><li>Al Tabaa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+polyclonal+activation+and+Epstein-Barr+viral+abortive+lytic+cycle+are+two+key+features+in+acute+infectious+mononucleosis.">B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis.</a> Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).</li><li>M, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+cell+transcriptome+during+primary+EBV+infection+and+EBV+associated+Hodgkin+Lymphoma+in+children-A+preliminary+observation.">Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation.</a> Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).</li><li>Greenough, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus:+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells.">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li><li>Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+post-transplant+lymphoproliferative+disorders.">Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders.</a> Cancers. 13 (8), 1836 (2021).</li><li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

يمثل هذا البروتوكول طريقة فعالة لفرز المجموعات الفرعية للخلايا المناعية للدم المحيطي. في هذه الدراسة ، تم اختيار عينات الدم الوريدي من المرضى الذين يعانون من IM ، وناقلات EBV الأصحاء ، والأطفال غير المصابين بفيروس EBV كهدف بحثي. يركز هذا العمل باستخدام الدم المحيطي لمرضى IM بشكل أساسي على تحلي...

فيروس إبشتاين بار (EBV) ، وهو فيروس الهربس γ المعروف أيضا باسم فيروس الهربس البشري من النوع 4 ، موجود في كل مكان في البشر ويؤسس عدوى كامنة مدى الحياة في أكثر من 90٪ من السكان البالغين1. تحدث معظم العدوى الأولية EBV خلال مرحلة الطفولة والمراهقة ، مع ظهور جزء صغير من المرضى مع عدد كريات الدم البيضاء المعدية (IM) 2 ، مما يدل على علم الأمراض المناعية المميزة ، بما في ذلك الاستجابة المناعية النشطة مع خلايا CD8 + T في الدم وانتشار عابر للخلايا البائية المصابة بفيروس EBV في البلعومالفموي 3. قد تستمر دورة الحقن العضلي لمدة 2-6 أسابيع ويتعافى غالبية المرضى بشكل جيد4. ومع ذلك ، يصاب بعض الأفراد بأعراض مستمرة أو متكررة تشبه IM مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات ، والتي تصنف على أنها عدوى EBV المزمنة النشطة (CAEBV)5. بالإضافة إلى ذلك ، يعد EBV فيروسا مهما للأورام ، يرتبط ارتباطا وثيقا بمجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة ، بما في ذلك الأورام الخبيثة الظهارية واللمفاوية مثل سرطان البلعوم البلعومي ، وسرطان الغدد الليمفاوية بوركيت ، وسرطان الغدد الليمفاوية هودجكين (HL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا T / NK6. على الرغم من دراسة EBV لأكثر من 50 عاما ، إلا أن التسبب في المرض والآلية التي يحفز بها تكاثر الخلايا الليمفاوية لم يتم توضيحها بالكامل.
بحثت العديد من الدراسات في التوقيعات الجزيئية لعلم الأمراض المناعي لعدوى EBV عن طريق تسلسل النسخ. قام Zhong et al. بتحليل التنميط الكامل للنسخ لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) من الأطفال الصينيين المصابين ب IM أو CAEBV ليجد أن توسع الخلايا التائية CD8 + تم العثور عليه في الغالب في مجموعة IM7 ، مما يشير إلى أن خلايا CD8 + T قد تلعب دورا رئيسيا في IM. وبالمثل ، وجدت دراسة أخرى نسبا أقل من الخلايا التائية السامة للخلايا وخلايا CD19 + B السامة للخلايا ونسب أعلى من خلايا CD8 + T في المرضى الذين يعانون من IM الناجم عن عدوى EBV الأولية مقارنة بالمرضى الذين يعانون من IM الناجم عن إعادة تنشيط EBV وعوامل أخرى8. تشارك الخلايا البائية أولا في العضلي؛ لأن مستقبلات EBV تظهر على سطحها. وجد الطباع وآخرون أن الخلايا البائية تم تنشيطها متعددة النسيلة وخلايا البلازما المتمايزة (خلايا CD19 + و CD27 + و CD20− و CD138−) وخلايا البلازما (CD19 + و CD27 + و CD20− و CD138 +) خلال IM9. علاوة على ذلك ، وجد Zhong et al. أن علامات الخلايا الوحيدة CD14 و CD64 تم تنظيمها في CAEBV ، مما يشير إلى أن الخلايا الوحيدة قد تلعب دورا مهما في الاستجابة المناعية الخلوية ل CAEBV من خلال السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) والبلعمة المفرطة النشاط7. Alka et al. ميز نسخ خلايا CD56 CD16 + NKالخافتة من أربعة مرضى من IM أو HL ووجد أن الخلايا القاتلة الطبيعية من كل من IM و HL قد خفضت المناعة الفطرية وجينات إشارات chemokine ، والتي يمكن أن تكون مسؤولة عن عدم استجابة الخلايا القاتلة الطبيعية10. بالإضافة إلى ذلك ، قام Greenough et al. بتحليل التعبير الجيني لخلايا CD8 + T المصنفة من 10 PBMCs للأفراد المصابين ب IM. وأفادوا أن نسبة كبيرة من الخلايا التائية CD8 + في IM كانت خاصة بالفيروسات ، وتم تنشيطها ، وتقسيمها ، واستعدادها لممارسة أنشطة المستجيب11. تلعب كل من الاستجابات بوساطة الخلايا التائية ، والاستجابات الخاصة ب EBV ، والاستجابات غير المحددة بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية ، أدوارا أساسية أثناء عدوى EBV الأولية. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات بحثت فقط في نتائج النسخ للخليط المتنوع من الخلايا المناعية أو مجموعة فرعية معينة فقط من الخلايا الليمفاوية ، وهو ما لا يكفي للمقارنة الشاملة للخصائص الجزيئية ووظائف مجموعات الخلايا المناعية المختلفة في الأطفال المصابين ب IM في نفس حالة المرض.
تصف هذه الورقة طريقة تجمع بين الخرز المغناطيسي المناعي وفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لعزل وتحليل مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية من PBMCs (الخلايا الوحيدة ، خلايا CD4 + T ، خلايا CD8 + T ، الخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تنقية الخلايا المغناطيسية والفلورية باستخدام فاصل مغناطيسي و FACS أو تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا المنقاة لتسلسل النسخ. ستمكن هذه الطريقة من توصيف الخلايا المناعية المختلفة والتعبير الجيني عنها في نفس حالات المرض للأفراد المصابين بالحقن العضلي ، مما سيوسع فهمنا لعلم الأمراض المناعي لعدوى EBV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

عدد كريات الدم البيضاء المعدية (IM) هو متلازمة حادة ترتبط في الغالب بعدوى فيروس إبشتاين بار الأولية (EBV). تشمل الأعراض السريرية الرئيسية الحمى غير المنتظمة ، واعتلال العقد اللمفية ، وزيادة الخلايا الليمفاوية بشكل ملحوظ في الدم المحيطي. لا تزال الآلية المسببة للأمراض في IM غير واضحة. لا توجد طريقة علاج فعالة لذلك ، مع توفر علاجات الأعراض بشكل أساسي. السؤال الرئيسي في علم الأحياء المناعي EBV هو لماذا تظهر مجموعة فرعية صغيرة فقط من الأفراد المصابين أعراضا سريرية حادة وحتى يصابون بأورام خبيثة مرتبطة ب EBV ، في حين أن معظم الأفراد لا تظهر عليهم أعراض مدى الحياة مع الفيروس.
تشارك الخلايا البائية أولا في العضلي؛ لأن مستقبلات EBV تظهر على سطحها. الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي خلايا ليمفاوية فطرية سامة للخلايا مهمة لقتل الخلايا المصابة بفيروس EBV. تنخفض نسبة الخلايا التائية CD4 + بينما تتوسع نسبة الخلايا التائية CD8 + بشكل كبير أثناء عدوى EBV الحادة ، واستمرار الخلايا التائية CD8 + مهم للسيطرة على العضلي مدى الحياة. تلعب هذه الخلايا المناعية أدوارا مهمة في العضل العضلي، ويجب تحديد وظائفها بشكل منفصل. لهذا الغرض ، يتم فصل الخلايا الوحيدة أولا عن خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لأفراد IM باستخدام ميكروبيدات CD14 وعمود وفاصل مغناطيسي.
يتم تلطيخ PBMCs المتبقية ببروتين بيريدين كلوروفيل (PerCP) / سيانين 5.5 مضاد CD3 ، ألوفيكوسيانين (APC) / سيانين 7 مضاد CD4 ، فيكوريثرين (PE) مضاد CD8 ، فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) مضاد CD19 ، APC مضاد CD56 ، و APC مضاد ل CD16 لفرز خلايا CD4 + T وخلايا CD8 + T والخلايا البائية وخلايا NK باستخدام مقياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، تم إجراء تسلسل النسخ لخمس مجموعات سكانية فرعية لاستكشاف وظائفها وآلياتها المسببة للأمراض في IM.

مرجع استراتيجية البوابات يوضح الشكل 1 استراتيجية البوابة المستخدمة لفرز المجموعات الفرعية الأربعة للخلايا الليمفاوية. باختصار ، يتم اختيار الخلايا الليمفاوية (P1) على مخطط نقطي يوضح التحبب (SSC-A) مقابل الحجم (FSC-A). بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا المفردة (P2) على مخطط نقط...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

وصفنا طريقة تجمع بين الخرز المغنطيسي المناعي وفرز الخلايا المنشط بالتألق لعزل وتحليل مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (الخلايا الوحيدة ، خلايا CD4 + T ، خلايا CD8 + T ، الخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تنقية الخلايا المغناطيسية والفلورية وتحليلها.

فصل المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المناعية في عينات الدم المحيطية من الأطفال المصابين بكثرة الوحيدات المعدية

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

ستمكن هذه الطريقة من توصيف الخلايا المناعية المختلفة في نفس حالات المرض للأفراد المصابين بالحقن العضلي ، مما سيوسع فهمنا لآلية عدوى EBV. سيوضح الإجراء Linlin Zhang ، وهو طبيب من مختبرنا. للبدء ، خذ PBMCs المعزولة مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتدويره عند 300 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا ب 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحضر. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من ميكروبيدات CD 14 إلى تعليق الخلية ، واخلطها جيدا عن طريق السحب ، واحتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة على الجليد. ثم اغسل PBMCs باستخدام ملليلتر واحد من المخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 300 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.تخلص من المادة الطافية بالكامل ، وأعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت. للفصل المغناطيسي ، ضع عمودا على فاصل الخرزة المغناطيسية ، وقم بتجهيز العمود عن طريق غسله بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت. بعد ذلك ، أضف تعليق الخلية إلى العمود.اسمح لها بالمرور ، واجمع الخلايا غير المصنفة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت ، واجمع النفايات السائلة بالكامل في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. الآن ، ضع العمود في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر ، وأضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت إلى العمود.ادفع المكبس بإحكام في العمود لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا في الأنبوب. جهاز طرد مركزي للخلايا المسماة مغناطيسيا عند 300 جم لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر لتسلسل النسخ اللاحق.قم بتكوير الخلايا غير المصنفة التي تم جمعها عن طريق الطرد المركزي عند 300 جم لمدة خمس دقائق ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من كل جسم مضاد مسمى إلى معلق الخلية ، واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة ، محميا من الضوء. بعد ذلك ، قم بتقسيم 100 ميكرولتر من تعليق خلية PBMC في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر لإعداد عينة تحكم سلبية CD 3 و CD 4 و CD 8 و CD 19 ، وعينات تلطيخ مفردة ، وعينة تلطيخ CD 56 أو CD 16.ثم أضف ميكرولترين من الجسم المضاد المقابل المسمى بالفلورسنت إلى كل أنبوب ، واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة ، محميا من الضوء. بعد الحضانة ، اغسل جميع الخلايا باستخدام PBS كما هو موضح سابقا ، وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من PBS. افتح نظام فرز الخلايا ، وقم بتشغيل برنامج التشغيل.بعد ذلك ، قم بتثبيت فوهة 85 ميكرومتر ، وافتح تيار الفرز. اضبط جهد الفرز على 4،500 فولت ، والتردد على 47. قم بإعداد الفجوة إلى 8 في نافذة الفاصل ، وقم بتشغيل وضع الفرز التلقائي للبقعة الحلوة لتحديد قيمة سعة القطرة تلقائيا.أخيرا ، اضبط تأخير القطرة على 30.31 في نافذة البث الجانبي. باستخدام مخطط نقطة تشتت أمامي مقابل جانبي ، ارسم بوابة المضلع P1 لتحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية السليمة. بعد ذلك ، باستخدام منطقة التشتت الأمامية مقابل مخطط نقطة الارتفاع ، ارسم بوابة المضلع P2 لتحديد الخلايا المفردة ، واستبعد المزدوجات.ثم باستخدام منطقة CD 19 FITC مقابل CD 3 لكل مخطط نقطي لمنطقة CPCY 5.5 ، ارسم البوابة المستطيلة P3 لتحديد خلايا T الموجبة CD 3 ، والخلايا البائية الإيجابية CD 19. بعد ذلك ، باستخدام مخطط نقطي لمنطقة CD 4 APCCY 7 مقابل مخطط نقطي لمنطقة CD 8 PE ، ارسم بوابة مستطيلة لتحديد CD 4 ، وخلايا T إيجابية CD 8. أخيرا ، باستخدام منطقة تشتت جانبية مقابل مخطط نقطي لمنطقة CD 56 أو CD 16 APC ، ارسم بوابة مستطيلة لتحديد CD 56 أو CD 16 الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية.بالنسبة لأنبوب التحكم السلبي ، انقر فوق تحميل في لوحة معلومات الاستحواذ ، وحدد إعدادات مقياس الخلايا في البرنامج. في نافذة المفتش ، انقر فوق علامة التبويب المعلمات ، واضبط الفولتية للتشتت الأمامي ، والتشتت الجانبي ، وأصباغ الفلورسنت المختلفة. بعد تحميل الأنابيب الملطخة المفردة في مقياس الخلوي ، انقر فوق تحميل في لوحة معلومات الاستحواذ ، ثم انقر فوق علامة تبويب التعويض لضبط التعويض ، كما هو موضح في النص.دوامة تعليق الخلية بلطف ، قبل تحميل الأنبوب في مقياس الخلايا. أضف 200 ميكرولتر من FBS إلى أربعة أنابيب تدفق تجميع ، وقم بتدوير الأنابيب. ضعها في غرفة جمع مقياس الخلايا.اجمع الأنواع المختلفة من الخلايا بشكل منفصل في أنابيب التدفق الأربعة. قم بتدوير الخلايا المنفصلة بمعدل 300 جم لمدة خمس دقائق ، وأضف 200 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي إلى لوحة الخلايا لتسلسل النسخ. في الدراسة الحالية ، تم فرز مجموعات الخلايا المناعية الفرعية من الدم المحيطي لعينات مختلفة بكفاءة من خلال الجمع بين تقنيات الخرز المغناطيسي المناعي ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة.الأهم من ذلك في هذا البروتوكول ، تم تحسين خطوة فرز الخلايا لتحسين صلاحية الخلية. أظهرت الخلايا المناعية المصنفة نسبة متزايدة من الخلايا التائية الإيجابية CD 3 و CD 8 في المرضى الذين يعانون من عدد كريات الدم البيضاء المعدية مقارنة بكل من حاملي فيروس Epstein-Barr الأصحاء والعينات غير المصابة. في المقابل ، لوحظ انخفاض نسب الخلايا التائية الإيجابية CD 3 و CD 4 والخلايا البائية الإيجابية CD 19 في المرضى الذين يعانون من عدد كريات الدم البيضاء المعدية مقارنة بحاملي EBV الأصحاء والأطفال غير المصابين بفيروس EBV.بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ انخفاض نسب CD 56 ، أو CD 16 الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية في المرضى الذين يعانون من عدد كريات الدم البيضاء المعدية مقارنة مع الأطفال غير المصابين EBV. الحفاظ على بقاء الخلية أمر حيوي للتجربة اللاحقة. يعد الاحتفاظ بالخلايا على الجليد أو في الثلاجة أثناء عملية الفرز مفيدا لبقاء الخلية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

نهج مؤتمتة شبه لإعداد الجسم المضاد الكوكتيلات لتحليل Immunophenotypic في الدم المحيطي الإنسان

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...