Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) en het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Bloedmonsters werden verkregen van patiënten met IM (n = 3), gezonde EBV-dragers (n = 3) en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen (n = 3). Vrijwilligers werden gerekruteerd uit het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, en alle studies werden ethisch goedgekeurd. Ethische goedkeuring werd verkregen door de ethische commissie van het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (goedkeuringsnummer: [2021]-E-056-Y). Er werd afgezien van geïnformeerde toestemming van patiënten, omdat de studie all...

<ol>
	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+virology,+and+immunologic+factors+associated+with+acquisition+and+severity+of+primary+Epstein-Barr+virus+infection+in+university+students.">Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).</li><li>Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+mononucleosis.">Infectious mononucleosis.</a> New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan.">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li><li>Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+infection+and+nasopharyngeal+carcinoma.">Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+reveals+major+cell+types+in+the+cellular+immune+response+against+acute+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection.">Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).</li><li>Fedyanina, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+clinical+significance+of+atypical+mononuclear+cells+in+infectious+mononucleosis+caused+by+the+Epstein-Barr+virus+in+children.">The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).</li><li>Al Tabaa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+polyclonal+activation+and+Epstein-Barr+viral+abortive+lytic+cycle+are+two+key+features+in+acute+infectious+mononucleosis.">B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis.</a> Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).</li><li>M, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+cell+transcriptome+during+primary+EBV+infection+and+EBV+associated+Hodgkin+Lymphoma+in+children-A+preliminary+observation.">Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation.</a> Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).</li><li>Greenough, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus:+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells.">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li><li>Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+post-transplant+lymphoproliferative+disorders.">Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders.</a> Cancers. 13 (8), 1836 (2021).</li><li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

Dit protocol is een efficiënte manier om subpopulaties van perifere immuuncellen in het bloed te sorteren. In deze studie werden veneuze bloedmonsters van patiënten met IM, gezonde EBV-dragers en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen geselecteerd als onderzoeksdoelstelling. Dit werk met behulp van het perifere bloed van patiënten met IM richt zich voornamelijk op het analyseren en bepalen van de verhoudingen van verschillende celsubsets door middel van meerkleurige flowcytometrie. Transcriptoomsequencing wordt voornamelijk...

Epstein-Barr-virus (EBV), een γ-herpesvirus ook bekend als humaan herpesvirus type 4, is alomtegenwoordig in de menselijke bevolking en vestigt levenslange latente infectie bij meer dan 90% van de volwassen bevolking1. De meeste PRIMAIRE EBV-infecties treden op tijdens de kindertijd en adolescentie, waarbij een fractie van de patiënten zich manifesteert met infectieuze mononucleosis (IM)2, met karakteristieke immunopathologie, waaronder een geactiveerde immuunrespons met CD8+ T-cellen in het bloed en een voorbijgaande proliferatie van EBV-geïnfecteerde B-cellen in de orofarynx3. Het verloop van IM kan 2-6 weken duren en de meerderheid van de patiënten herstelt goed4. Sommige personen ontwikkelen echter aanhoudende of terugkerende IM-achtige symptomen met een hoge morbiditeit en mortaliteit, die is geclassificeerd als chronische actieve EBV-infectie (CAEBV)5. Bovendien is EBV een belangrijk oncogene virus, dat nauw verwant is aan een verscheidenheid aan maligniteiten, waaronder epithelioïde en lymfoïde maligniteiten zoalsnasofaryngeaal carcinoom, Burkitt-lymfoom, Hodgkin-lymfoom (HL) en T / NK-cellymfoom6. Hoewel EBV al meer dan 50 jaar wordt bestudeerd, zijn de pathogenese en het mechanisme waarmee het de proliferatie van lymfocyten induceert, niet volledig opgehelderd.
Verschillende studies hebben de moleculaire handtekeningen voor de immunopathologie van EBV-infectie onderzocht door transcriptoomsequencing. Zhong et al. analyseerden volledige transcriptoomprofilering van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van Chinese kinderen met IM of CAEBV om te ontdekken dat CD8 + T-celexpansie voornamelijk werd gevonden in de IM-groep7, wat suggereert dat CD8 + T-cellen een belangrijke rol kunnen spelen bij IM. Evenzo vond een andere studie lagere percentages EBV-specifieke cytotoxische T- en CD19 + B-cellen en hogere percentages CD8 + T-cellen bij patiënten met IM veroorzaakt door primaire EBV-infectie dan bij patiënten met IM veroorzaakt door zowel EBV-reactivatie als andere middelen8. B-cellen zijn voor het eerst betrokken bij IM omdat EBV-receptoren op hun oppervlak worden gepresenteerd. Al Tabaa et al. vonden dat B-cellen polyclonaal geactiveerd en gedifferentieerd waren inplasmablasten (CD19+, CD27+ en CD20−, en CD138− cellen) en plasmacellen (CD19+, CD27+ en CD20−, en CD138+) tijdens IM9. Bovendien vonden Zhong et al. dat monocytmarkers CD14 en CD64 werden geupreguleerd in CAEBV, wat suggereert dat monocyten een belangrijke rol kunnen spelen in de cellulaire immuunrespons van CAEBV via antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) en hyperactieve fagocytose7. Alka et al. karakteriseerden het transcriptoom van MACS gesorteerde CD56dim CD16+ NK cellen van vier patiënten van IM of HL en vonden dat NK-cellen van zowel IM als HL gedownreguleerde aangeboren immuniteit en chemokine signaleringsgenen hadden, die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de hyporesponsiviteit van NK-cellen10. Daarnaast analyseerden Greenough et al. genexpressie van gesorteerde CD8 + T-cellen van 10 PBMC's van personen met IM. Ze meldden dat een groot deel van de CD8 + T-cellen in IM virusspecifiek, geactiveerd, delend en klaargestoomd waren om effectoractiviteiten uit te oefenen11. Zowel T-cel-gemedieerde, EBV-specifieke responsen als NK-cel-gemedieerde, niet-specifieke responsen spelen essentiële rollen tijdens primaire EBV-infectie. Deze studies onderzochten echter alleen de transcriptoomresultaten van het diverse mengsel van immuuncellen of alleen een bepaalde subpopulatie van lymfocyten, wat niet voldoende is voor de uitgebreide vergelijking van de moleculaire kenmerken en functies van verschillende immuuncelsubpopulaties bij kinderen met IM in dezelfde ziektetoestand.
Dit artikel beschrijft een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van PBMC's (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en NK-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd met behulp van een magnetische separator en FACS of worden geanalyseerd door flowcytometrie. RNA kan uit de gezuiverde cellen worden geëxtraheerd voor transcriptoomsequencing. Deze methode zal de karakterisering en genexpressie van verschillende immuuncellen in dezelfde ziektetoestanden van personen met IM mogelijk maken, wat ons begrip van de immunopathologie van EBV-infectie zal vergroten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

Infectieuze mononucleosis (IM) is een acuut syndroom dat meestal wordt geassocieerd met primaire Epstein-Barr-virus (EBV) -infectie. De belangrijkste klinische symptomen zijn onregelmatige koorts, lymfadenopathie en significant verhoogde lymfocyten in perifeer bloed. Het pathogene mechanisme van IM is nog onduidelijk; er is geen effectieve behandelmethode voor, waarbij voornamelijk symptomatische therapieën beschikbaar zijn. De belangrijkste vraag in EBV-immunobiologie is waarom slechts een kleine subgroep van geïnfecteerde personen ernstige klinische symptomen vertoont en zelfs EBV-geassocieerde maligniteiten ontwikkelt, terwijl de meeste personen asymptomatisch zijn voor het leven met het virus.
B-cellen zijn voor het eerst betrokken bij IM omdat EBV-receptoren op hun oppervlak worden gepresenteerd. Natural killer (NK) cellen zijn cytotoxische aangeboren lymfocyten die belangrijk zijn voor het doden van EBV-geïnfecteerde cellen. Het aandeel CD4+ T-cellen neemt af, terwijl dat van CD8+ T-cellen dramatisch uitbreidt tijdens acute EBV-infectie, en de persistentie van CD8+ T-cellen is belangrijk voor levenslange controle van IM. Die immuuncellen spelen een belangrijke rol in IM en hun functies moeten afzonderlijk worden geïdentificeerd. Voor dit doel worden monocyten eerst gescheiden van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) van IM-individuen met behulp van CD14-microbeads, een kolom en een magnetische separator.
De resterende PBMC's zijn gekleurd met peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP)/Cyanine 5,5 anti-CD3, allophycocyanine (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 en APC anti-CD16 antilichamen om CD4+ T cellen, CD8+ T cellen, B cellen en NK cellen te sorteren met behulp van een flow cytometer. Bovendien werd transcriptoomsequencing van vijf subpopulaties uitgevoerd om hun functies en pathogene mechanismen in IM te onderzoeken.

Referentie van de gatingstrategie De gatingstrategie die wordt gebruikt om de vier lymfocytensubpopulaties te sorteren, is weergegeven in figuur 1. Kortom, lymfocyten worden geselecteerd (P1) op een dot plot die de granulositeit (SSC-A) versus grootte (FSC-A) weergeeft. Vervolgens worden afzonderlijke cellen geselecteerd (P2) op een dot plot met de grootte (FSC-A) versus forward scatter (FSC-H), terwijl doubletcellen worden uitgesloten. CD3+ T-cellen (P3) en CD...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

We beschrijven een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van perifere mononucleaire bloedcellen (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en natural killer-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd en geanalyseerd.

Scheiding van immuuncelsubpopulaties in perifere bloedmonsters van kinderen met infectieuze mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Deze methode zal de karakterisering van verschillende immuuncellen in dezelfde ziektetoestanden van personen met IM mogelijk maken, wat ons begrip van het mechanisme van EBV-infectie zal vergroten. De procedure wordt gedemonstreerd door Linlin Zhang, een arts van ons laboratorium. Neem om te beginnen de PBMC's die eerder zijn geïsoleerd in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en draai deze gedurende 10 minuten op 300 G bij kamertemperatuur.Gooi het supernatant weg en suspensieer de cellen opnieuw met 80 microliter van de voorbereide buffer. Voeg vervolgens 20 microliter CD 14 microbeads toe aan de celsuspensie, goed gemengd door pipetteren, en incubeer de buis gedurende 15 minuten op ijs. Was vervolgens de PBMC's met één milliliter buffer en centrifugeer op 300 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Gooi het hele supernatant weg en suspensieer de cellen opnieuw met 500 microliter van de buffer. Plaats voor magnetische scheiding een kolom op de magnetische kraalscheider en prime de kolom door deze te wassen met drie milliliter van de buffer. Voeg vervolgens de celsuspensie toe aan de kolom.Laat het door en verzamel de niet-gelabelde cellen in een centrifugebuis van 15 milliliter. Was de kolom drie keer met drie milliliter van de buffer en verzamel het volledige effluent in een centrifugebuis van 15 milliliter. Plaats de kolom nu in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter en voeg vijf milliliter buffer toe aan de kolom.Duw de zuiger stevig in de kolom om de magnetisch gelabelde cellen in de buis te spoelen. Centrifugeer de magnetisch gelabelde cellen op 300 G gedurende vijf minuten. Na het verwijderen van het supernatant, suspensie de cellen opnieuw in 500 microliter PBS en breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor daaropvolgende transcriptoomsequencing.Pelleteer de verzamelde niet-gelabelde cellen door gedurende vijf minuten te centrifugeren op 300 G en suspensieer de cellen opnieuw in 100 microliter PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens twee microliter van elk gelabeld antilichaam toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Vervolgens aliquot 100 microliter van de PBMC-celsuspensie in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter om een negatief controlemonster CD 3, CD 4, CD 8 en CD 19, enkele kleuringsmonsters en een CD 56- of CD 16-kleuringsmonster op te zetten.Voeg vervolgens twee microliter van het overeenkomstige fluorescerend gelabelde antilichaam toe aan elke buis en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Was na incubatie alle cellen met PBS zoals eerder aangetoond en suspensie opnieuw in 500 microliter PBS. Open het celsorteersysteem en voer het stroomprogramma uit.Installeer vervolgens het mondstuk van 85 micrometer en open de sorteerstroom. Stel de sorteerspanning in op 4.500 volt en de frequentie op 47. Stel de opening in op 8 in het afbreekvenster en schakel de automatische sweet spot-sorteermodus in om de amplitudewaarde van de druppel automatisch te bepalen.Stel ten slotte de druppelvertraging in op 30,31 in het zijstroomvenster. Teken met behulp van een voorwaartse versus zijwaartse spreidingspuntplot de polygoonpoort P1 om de intacte lymfocytenpopulatie te identificeren. Teken vervolgens met behulp van een voorwaarts spreidingsgebied versus hoogtepuntplot de polygoonpoort P2 om de enkele cellen te identificeren en doubletten uit te sluiten.Gebruik vervolgens een CD 19 FITC-gebied versus CD 3 per CPCY 5.5-gebiedspuntenplot, teken de rechthoekige poort P3 om CD 3-positieve T-cellen en CD 19-positieve B-cellen te selecteren. Teken vervolgens met behulp van een CD 4 APCCY 7-gebied versus CD 8 PE-gebiedspuntplot een rechthoekige poort om CD 4- en CD 8-positieve T-cellen te selecteren. Teken ten slotte met behulp van een zijverstrooiingsgebied versus CD 56 of CD 16 APC-gebiedspuntplot een rechthoekige poort om CD 56- of CD 16-positieve natural killer-cellen te selecteren.Klik voor de negatieve controlebuis op laden in het acquisitiedashboard en selecteer de cytometerinstellingen in de software. Klik in het controlevenster op het tabblad Parameters en pas de spanningen van voorwaartse verstrooiing, zijverstrooiing en verschillende fluorescerende kleurstoffen aan. Nadat u de enkele gekleurde buizen in de cytometer hebt geladen, klikt u op laden in het acquisitiedashboard en klikt u vervolgens op het tabblad compensatie om de compensatie aan te passen, zoals beschreven in de tekst.Vortex de celsuspensie voorzichtig, voordat de buis in de cytometer wordt geladen. Voeg 200 microliter FBS toe aan vier verzamelstroombuizen en vortex de buizen. Plaats ze in de verzamelkamer van de cytometer.Verzamel de verschillende soorten cellen afzonderlijk in de vier stromingsbuizen. Draai de gescheiden cellen gedurende vijf minuten op 300 G en voeg 200 microliter RNA-isolatiereagens toe aan het celpalet voor transcriptoomsequencing. In de huidige studie werden immuuncellen subpopulaties uit perifeer bloed van verschillende monsters efficiënt gesorteerd door de technieken van immunomagnetische kralen en fluorescentie geactiveerde celsortering te combineren.Belangrijk in dit protocol is dat de celsorteerstap is geoptimaliseerd om de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren. De gesorteerde immuuncellen vertoonden een verhoogd aandeel CD 3, CD 8 positieve T-cellen bij patiënten met infectieuze mononucleosis in vergelijking met zowel de gezonde Epstein-Barr-virusdragers als niet-geïnfecteerde monsters. Daarentegen werden verminderde proporties van CD 3, CD 4 positieve T-cellen en CD 19 positieve B-cellen waargenomen bij patiënten met infectieuze mononucleosis in vergelijking met gezonde EBV-dragers en EBV niet-geïnfecteerde kinderen.Bovendien werden verlaagde proporties van CD 56 of CD 16 positieve natural killer cellen waargenomen bij patiënten met infectieuze mononucleosis in vergelijking met EBV niet-geïnfecteerde kinderen. Het handhaven van de levensvatbaarheid van cellen is van vitaal belang voor latere experimenten. Het bewaren van cellen op ijs of in de koelkast tijdens het sorteerproces is gunstig voor de levensvatbaarheid van cellen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Een semi-automatische Aanpak Voorbereiding Antibody Cocktails voor Immunophenotypic Analyse van de humane perifere bloed

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...