Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Statens Institut for Diabetes og Fordøjelses- og Nyresygdomme (NIDDK) til JMB (DK117884).

Alle procedurer, der udføres på gnavere, skal overholde de gældende retningslinjer og godkendes af den lokale institutionelle etiske vurderingskomité. Eksperimenterne udført til dette manuskript blev udført i overensstemmelse med National Research Council's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh School of Medicine. Se figur 1 for en modificeret version af standardopsætningen af gn...

<ol>
	<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+urinary+tract+in+health+and+disease.">Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease.</a> Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Autonomic Neuroscience: Basic &amp; Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).</li><li>Silva-Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+may+be+a+dynamic+biomarker+of+detrusor+overactivity+in+women+with+overactive+bladder+syndrome.">Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome.</a> PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).</li><li>Sun, Y., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+extracellular+ATP+signaling+in+bladder+urothelial+cells+from+patients+with+interstitial+cystitis.">Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).</li><li>Gill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+as+an+indicator+of+infection+and+inflammation+of+the+urinary+tract+in+patients+with+lower+urinary+tract+symptoms.">Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms.</a> BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).</li><li>S&#228;ve, S., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+and+P2Y+receptor+activation+induce+a+proinflammatory+host+response+in+the+human+urinary+tract.">Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).</li><li>Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overactive+and+underactive+bladder+dysfunction+is+reflected+by+alterations+in+urothelial+ATP+and+NO+release.">Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release.</a> Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).</li><li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder.">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).</li><li>Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+long-term+culture+of+differentiated+normal+rat+urothelial+cells+in+vitro.">Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).</li><li>Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+instillation+procedure+in+adult+male+mouse.">Transurethral instillation procedure in adult male mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).</li><li>Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+in+a+small+animal+model:+Transurethral+catheterization+of+male+and+female+mice.">Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).</li><li>Uvin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cystometry+in+small+rodents:+a+study+of+bladder+chemosensation.">The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).</li><li>Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+oxidation+of+luciferin+without+luciferase+and+the+mechanism+of+bioluminescence.">Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence.</a> Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

Størstedelen af forskningen i urothelial ATP-frigivelse udføres i dyrkede celler ved hjælp af enten udødeliggjorte cellelinjer eller primære kulturer af gnaverurothelceller . Mens disse modeller har fordelen ved at være relativt høj gennemstrømning (dvs. en kultur / passage kan lave mange plader / skåle af celler), mindskes deres fysiologiske relevans på grund af: 1) urothelcellers manglende evne til at vokse polariseret, medmindre de dyrkes på specielle understøtninger og 2) vanskeligheden ved at udsætte dy...

Urin ATP menes at spille en væsentlig sensorisk rolle i kontrollen af mikturering1. For eksempel menes det, at ATP frigives fra urothelium som reaktion på distension, hvor det kan virke på receptorer på blæreafferente nerver for at øge deres excitabilitet, hvilket fører til fornemmelser af fylde2. Således menes det også, at urin-ATP kan være en vigtig aktør i udviklingen af blærepatologier. Til støtte for denne hypotese øges ATP-koncentrationerne i urinen signifikant hos patienter, der lider af overaktiv blære (OAB)3, blærepinesyndrom/interstitiel cystitis (BPS/IC)4 eller en urinvejsinfektion (UTI)5,6, alle tilstande karakteriseret ved øget haster, hyppighed og undertiden smerte. Omvendt har patienter, der lider af underaktiv blære (UAB), som er karakteriseret ved manglende evne til at tømme blæren og undertiden kan omfatte en nedsat evne til at mærke blærens fylde, vist sig at have nedsat ATP-koncentrationer i urinen7. Eksperimentelt kan manipulation af ATP-koncentrationer i urinen ændre blærereflekser hos rotten; stigende ATP-koncentrationer ved at blokere endogene ATPaser i blærens lumen kan øge tømningsfrekvensen, mens faldende ATP-koncentrationer ved at indføre eksogene ATPaser i blæren reducerer tømningsfrekvensen8. Således er betydningen af urin ATP til blærefunktion klar.
I betragtning af den tilsyneladende betydning af urin-ATP for blærepatologi er nøjagtig måling af urothelial ATP-frigivelse et vigtigt skridt i forståelsen af de mekanismer, der styrer frigivelsen. Mange undersøgelser er afsluttet ved hjælp af forskellige eksperimentelle modeller til måling af urothelial ATP-frigivelse. Først og fremmest blandt disse er cellekulturer, enten primære kulturer eller cellelinjer. Imidlertid kompliceres brugen af dyrkede urothelceller af det faktum, at urothelceller ikke påtager sig deres fysiologiske polariserede morfologi, medmindre de dyrkes på specielle permeable membraner (såsom Transwell-teknologi [brøndindsatser])9. Det er således vanskeligt at relatere enhver ATP-frigivelse målt til fysiologi. Urotelceller dyrket på brøndindsatser kan polarisere og danne en barriere, der ligner det, der ses in vivo; Imidlertid kan væksten af et fuldt differentieret urothelium tage dage eller uger. Derudover, mens det er muligt at montere brøndindsatser i et Ussing-kammer og lægge pres på den apikale side for at forårsage strækning, er det vanskeligt at anvende tilstrækkeligt tryk til at efterligne tilstande inde i blæren under patologi (dvs. tryk på 30 cm H2O eller derover). Hele blærevæv kan også monteres i et Ussing-kammer til strækforsøg, men dette fjerner blæren fra organismen sammen med de trofiske faktorer, der opretholder urothelialcellesundhed og dermed urothelial barrierefunktion. Derfor er den mest fysiologisk relevante måde at studere frigivelsen af ATP fra urothelium som reaktion på strækning eller tryk in vivo. De kirurgiske teknikker, der er nødvendige for at gennemføre forsøget, er identiske med dem, der almindeligvis anvendes i dyrecystometri, og bør derfor let udføres af alle, der er fortrolige med denne teknik.
I denne protokol vil vi beskrive den teknik, der anvendes til at undersøge luminal ATP hos kvindelige Sprague Dawley-rotter, der vejer ca. 200-250 g, da den transurethrale kateterisering beskrevet nedenfor er meget lettere hos kvinder; Imidlertid kan transuretral kateterisering også udføres hos mandlige gnavere10. Da transuretral kateterisering nu også er udført på mus af begge køn11, kan disse eksperimenter let tilpasses mus eller rotter af begge køn eller af varierende størrelse afhængigt af forskerholdets behov.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

ATP, frigivet fra urothelium som reaktion på blæreudspiling, menes at spille en væsentlig sensorisk rolle i kontrollen af mikturering. Derfor er nøjagtig måling af urothelial ATP-frigivelse i en fysiologisk indstilling et vigtigt første skridt i at studere de mekanismer, der styrer purinerg signalering i urinblæren. Eksisterende teknikker til at studere mekanisk fremkaldt urothelial ATP-frigivelse udnytter dyrkede celler belagt på fleksible understøtninger eller blærevæv fastgjort i Ussing-kamre; Imidlertid efterligner hver af disse teknikker ikke fuldt ud forholdene i den intakte blære. Derfor blev der udviklet en eksperimentel opsætning til direkte måling af ATP-koncentrationer i lumen i gnaverurinblæren.
I denne opsætning perfuseres blærerne af bedøvede gnavere gennem katetre i både blærens kuppel og via den ydre urinrørsåbning. Trykket i blæren øges ved at dække urinrørets kateter, mens steril væske perfuseres ind i blæren gennem kuplen. Måling af intravesikalt tryk opnås ved hjælp af en tryktransducer, der er fastgjort til blærekuppelkateteret, svarende til den opsætning, der anvendes til cystometri. Når det ønskede tryk er nået, fjernes urinrørets kateterhætte, og væske opsamles til ATP-kvantificering ved luciferin-luciferase-assay. Gennem denne eksperimentelle opsætning kan mekanismerne, der styrer både mekanisk og kemisk stimulering af urothelial ATP-frigivelse, undersøges ved at inkludere forskellige agonister eller antagonister i perfusatet eller ved at sammenligne resultater mellem vildtype og genetisk modificerede dyr.

Den beskrevne protokol muliggør nøjagtig måling af urothelial ATP-frigivelse in vivo fra blærens lumen ved hjælp af en modificeret version af standard gnavercystometriopsætningen (se figur 1). Dette gør det muligt for forskeren at undersøge virkningerne af lægemidler på stretch-medieret ATP-frigivelse i en fysiologisk indstilling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64227/64227fig...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Denne protokol beskriver proceduren til måling af ATP-koncentrationer i blærens lumen i en bedøvet gnaver.

In vivo Luminal måling af distension-fremkaldt urothelial ATP-frigivelse hos gnavere

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Vores protokol måler ATP, en vigtig transmitter i urinblæren, som giver os mulighed for yderligere at forhøre de mekanismer, der styrer dens frigivelse. Vores teknik måler ATP direkte fra blærens lumen, hvilket gør det mere fysiologisk relevant end teknikker, der bruger dyrkede celler eller blærevæv. Demonstration af proceduren vil være Keara Healy og Stephanie Daugherty, forskningsteknikere i mit laboratorium.Til at begynde med induceres indledende anæstesi ved at placere dyret i en lukket kasse gasset med 4% til 5% isofluran i ilt. Subkutant administrere uretan bilateralt, og placer derefter dyret i et bur for at lade urethanen træde i kraft i næsten to timer. Efter at have ventet på, at urethanen træder i kraft, skal du teste for et ordentligt anæstesiplan ved at klemme dyrets fod ved hjælp af tang.For at forhindre sammentrækning af blæren som reaktion på distension under eksperimentet, injicer dyret med et ganglionisk blokerende middel, hexamethonium. Påfør derefter oftalmisk salve på dyrets øjne for at forhindre tørring under eksperimentet. Barber nu dyrets mave og udfør en midterlinje laparotomi for at udsætte urinblæren.Brug en flamme til at blusse den ene ende af en kort længde PE50 intramedicinsk slange, læg en 22-gauge nål i den anden ende af slangen og fyld den med Krebs-opløsning. Placer en lille løkke af 3-0 silkesutur over blærens kuppel og udfør en lille cystostomi for at indsætte den flared ende af kateteret. Mens du holder kateteret med den ene hånd, skal du stramme suturløkken for at fastgøre kateteret på plads med den anden hånd.Afslut fastgørelsen af kateteret ved at binde to knuder i suturen. Træk kateteret tilbage, indtil det flared hoved er i kontakt med blærevæggen. Test opsætningen for lækager ved at infundere en lille mængde Krebs-opløsning gennem kateteret.Dyp enden af et IV-kateter i kirurgisk smøremiddel. Hold forsigtigt den ydre urethral meatus med et par tang, og indsæt spidsen af kateteret i urinrørsåbningen i retning af halen, som beskrevet i manuskriptet. Drej kateteret 90 grader og gå forsigtigt frem.Indsæt kateteret, indtil luerlåsnavet er fem millimeter distalt fra den ydre urinrørsåbning. Fastgør kateteret og forhindre lækage omkring kateteret ved at løkke en kort længde på 3-0 silkesutur omkring den ydre urinrørskød og binde den tæt af. Fastgør kateteret til halen med tape for at forhindre, at det ved et uheld trækkes ud.Når det er kateteriseret, skal Krebs-opløsningen forsigtigt injiceres i blæren gennem det suprapubiske blærekateter, og bekræfte, at væsken strømmer ud af urethralkateteret og ikke omkring det. Luk abdominalsnittet over blæren ved hjælp af en 3-0 silkesutur. Placer en absorberende underpude på en varmepude for at opretholde kropsvarmen og absorbere væske.Fastgør dyret på det skrånende bord for at hjælpe med at dræne intravesikal væske gennem urinrøret, og tænd derefter varmepuden. Tilslut det suprapubiske kateter til en trevejs stophane, der forbinder kateteret med en sprøjtepumpe og en tryktransducer. Tilslut tryktransduceren til en computer via en forstærker og et dataindsamlingssystem.Tilfør Krebs-opløsningen gennem det suprapubiske kateter med en hastighed på 0,1 ml pr. Minut, og lad væsken dræne gennem urinrøret kateteret i en time for at vaske enhver resterende ATP, der frigives under kateterimplantationerne. Efter denne udvaskningsperiode skal du hætte urethralkateteret ved hjælp af en luer-låseprop. Mål trykket i blæren og se efter en langsom stigning i det intravesiske tryk til et tryk på 30 centimeter vand uden en kraftig stigning i trykket, hvilket indikerer en blærekontraktion.Fjern stikket fra urinrøret, når trykket når 30 centimeter vand for at forhindre beskadigelse af blæren. Tilsæt blæren og saml elueringsmidlet fra urethralkateteret. Der testes straks 100 mikroliter delprøver af elueringsmidlet for ATP eller fryses til senere batchkvantificering.For at teste effekten af blæreudspilingen på luminale ATP-koncentrationer skal du hætte urethralkateteret med stikket og overvåge blæretrykket, indtil det når det ønskede niveau, derefter fjerne hætten på urinrørskateteret og samle elueringsmidlet til ATP-måling eller frysning som beskrevet ovenfor. Efter hver distension lad blæren hvile og vaske ud i 10 til 15 minutter, før du tager yderligere prøver. For at teste virkningen af lægemidler på frigivelsen af ATP skal du skifte Krebs-opløsningen, der infunderer blæren, til Krebs, der indeholder det valgte lægemiddel.Perfus lægemidlet i 10 til 15 minutter for at have en effekt, og saml derefter prøverne fra ikke-udspilede og udspilede blærer, som vist tidligere. Anbring 100 mikroliter prøve af perfusat med 50 mikroliter af analyseblandingen i luminometeret til aflæsning. For at konvertere fra relative lysenheder til ATP-koncentration skal der foretages serielle fortyndinger af ATP i Krebs-opløsning, der spænder fra en mikromolær til 10 picomolær i ti gange fortyndinger for at skabe en standardkurve og læse dem i luminometeret.De resulterende aflæsninger plottes på en graf, og der udføres en ikke-lineær regression for at ekstrapolere koncentrationer fra prøverne fra dyret. Infusion af opløsningen i blæren, mens urethralkateteret er tilsluttet, får intravesikalt tryk til at stige kraftigt, når blæren trækker sig sammen. Efter administration af hexamethonium blev der observeret en mere gradvis stigning i intravesikalt tryk, hvilket gjorde det muligt for trykket at stige så højt som 30 centimeter vand uden sammentrækning.Brilliant blue FCF reducerer signifikant hældningen af standardkurven, tilstrækkelig til at ændre de beregnede værdier for koncentrationen af ATP i prøven. Beregning af koncentrationen af ATP i en prøve ved hjælp af Krebs-standarden, der indeholder strålende blå FCF, kan resultere i en undervurdering af ATP-koncentrationen med 50%Udspiling af blæren øger luminale ATP-koncentrationer, som kan formindskes i nærvær af NTPDase-apvrase eller øges, når endogene NTPD-ACE'er hæmmes med ARL67156. Den stretch-inducerede ATP-frigivelse fra urothelium blev analyseret.Distension-fremkaldt ATP-frigivelse blokeres af panectinkanalantagonisterne, strålende blå FCF og carbonoxolon, men ikke med en forbindelseskanalantagonist, 18 alfa-glycyrrhetinsyre. Det er bydende nødvendigt, at alle luminometeraflæsninger konverteres til koncentrationer af ATP ved hjælp af den passende standardkurve, da Lucifer Luciferase-reaktionen er meget modtagelig for interferens fra en lang række forskellige midler. Vores teknik kunne bruges til at studere den distension-fremkaldte frigivelse af ethvert molekyle i blærens lumen, forudsat at der findes et passende assay for det molekyle.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Måling af Mouse Pulmonal endoteloverfladen Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Nethindeløsning Model i Gnavere ved subretinal Injektion af Natriumhyaluronats

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Slow-release Drug Delivery gennem Elvax 40W til rotteretina: konsekvenser for behandlingen af ​​kroniske lidelser

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Fjernbetjening Limb iskæmisk konditionering: En neuroprotektiv Teknik i Gnavere

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetri måler Mouse kontraktile Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transkutan vurdering af nyrefunktionen i bevidste Gnavere

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Forberedelsestrinnene til måling af reaktivitet i mus Retinal arterioler Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Brug af en kemisk biopsi til graft kvalitetsvurdering

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...