Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) aan JMB (DK117884).

Alle procedures die bij knaagdieren worden uitgevoerd, moeten voldoen aan de toepasselijke richtlijnen en worden goedgekeurd door de lokale institutionele ethische beoordelingscommissie. De experimenten die voor dit manuscript werden uitgevoerd, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Research Council en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Pittsburgh School of Medicine. Zie <strong class="xf...

<ol>
	<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+urinary+tract+in+health+and+disease.">Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease.</a> Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Autonomic Neuroscience: Basic &amp; Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).</li><li>Silva-Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+may+be+a+dynamic+biomarker+of+detrusor+overactivity+in+women+with+overactive+bladder+syndrome.">Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome.</a> PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).</li><li>Sun, Y., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+extracellular+ATP+signaling+in+bladder+urothelial+cells+from+patients+with+interstitial+cystitis.">Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).</li><li>Gill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+as+an+indicator+of+infection+and+inflammation+of+the+urinary+tract+in+patients+with+lower+urinary+tract+symptoms.">Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms.</a> BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).</li><li>S&#228;ve, S., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+and+P2Y+receptor+activation+induce+a+proinflammatory+host+response+in+the+human+urinary+tract.">Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).</li><li>Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overactive+and+underactive+bladder+dysfunction+is+reflected+by+alterations+in+urothelial+ATP+and+NO+release.">Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release.</a> Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).</li><li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder.">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).</li><li>Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+long-term+culture+of+differentiated+normal+rat+urothelial+cells+in+vitro.">Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).</li><li>Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+instillation+procedure+in+adult+male+mouse.">Transurethral instillation procedure in adult male mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).</li><li>Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+in+a+small+animal+model:+Transurethral+catheterization+of+male+and+female+mice.">Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).</li><li>Uvin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cystometry+in+small+rodents:+a+study+of+bladder+chemosensation.">The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).</li><li>Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+oxidation+of+luciferin+without+luciferase+and+the+mechanism+of+bioluminescence.">Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence.</a> Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

Het grootste deel van het onderzoek naar urotheliale ATP-afgifte wordt uitgevoerd in gekweekte cellen, met behulp van onsterfelijke cellijnen of primaire culturen van knaagdierurotheelcellen. Hoewel deze modellen het voordeel hebben dat ze een relatief hoge doorvoersnelheid hebben (d.w.z. één cultuur / passage kan veel platen / schotels van cellen maken), wordt hun fysiologische relevantie verminderd als gevolg van: 1) het onvermogen van urotheelcellen om gepolariseerd te groeien tenzij ze op speciale steunen worden ge...

Urinaire ATP wordt verondersteld een belangrijke sensorische rol te spelen bij de controle van mictie1. Er wordt bijvoorbeeld gedacht dat ATP wordt vrijgegeven uit het urotheel als reactie op uitzetting, waar het kan inwerken op receptoren op blaasafferente zenuwen om hun prikkelbaarheid te vergroten, wat leidt tot sensaties van volheid2. Er wordt dus ook gedacht dat urine-ATP een belangrijke speler kan zijn in de ontwikkeling van blaaspathologieën. Ter ondersteuning van deze hypothese zijn de ATP-concentraties in de urine significant verhoogd bij patiënten die lijden aan een overactieve blaas (OAB)3, blaaspijnsyndroom/interstitiële cystitis (BPS/IC)4, of een urineweginfectie (UTI)5,6, allemaal aandoeningen die worden gekenmerkt door verhoogde urgentie, frequentie en soms pijn. Omgekeerd is aangetoond dat patiënten die lijden aan een onderactieve blaas (UAB), die wordt gekenmerkt door een onvermogen om de blaas te legen en soms een verminderd vermogen kan hebben om blaasvolheid te voelen, verlaagde ATP-concentraties in de urine hebben7. Experimenteel kan manipulatie van ATP-concentraties in de urine de blaasreflexen bij de rat veranderen; het verhogen van ATP-concentraties door het blokkeren van endogene ATPasen in het blaaslumen kan de leegtefrequentie verhogen, terwijl het verlagen van ATP-concentraties door exogene ATPasen in de blaas te brengen de ledigingsfrequentie vermindert8. Het belang van urine-ATP voor de blaasfunctie is dus duidelijk.
Gezien het schijnbare belang van atp in de urine voor blaaspathologie, is nauwkeurige meting van urotheliale ATP-afgifte een belangrijke stap in het begrijpen van de mechanismen die de afgifte regelen. Veel studies zijn voltooid met behulp van verschillende experimentele modellen om de afgifte van urotheliale ATP te meten. De belangrijkste hiervan zijn celculturen, primaire culturen of cellijnen. Het gebruik van gekweekte urotheelcellen wordt echter bemoeilijkt door het feit dat urotheelcellen hun fysiologische gepolariseerde morfologie niet aannemen, tenzij ze worden gekweekt op speciale permeabele membranen (zoals Transwell-technologie [putinzet])9. Het is dus moeilijk om een ATP-afgifte gemeten te relateren aan de fysiologie. Urotheelcellen gekweekt op putinzetstukken kunnen polariseren en een barrière vormen die lijkt op wat in vivo wordt gezien; de groei van een volledig gedifferentieerd urotheel kan echter dagen of weken duren. Bovendien, hoewel het mogelijk is om putinzetstukken in een ussingkamer te monteren en druk uit te oefenen op de apicale kant om rek te veroorzaken, is het moeilijk om voldoende druk uit te oefenen om de omstandigheden in de blaas na te bootsen tijdens pathologie (d.w.z. drukken van 30 cm H2O of hoger). Heel blaasweefsel kan ook in een Ussing-kamer worden gemonteerd voor stretchexperimenten, maar dit verwijdert de blaas uit het organisme samen met de trofische factoren die de gezondheid van de urotheelcel en dus de urotheliale barrièrefunctie behouden. Daarom is de meest fysiologisch relevante manier om de afgifte van ATP uit het urotheel te bestuderen als reactie op rek of druk in vivo. De chirurgische technieken die nodig zijn om het experiment op te zetten, zijn identiek aan die welke vaak worden gebruikt in de cystometrie bij dieren en moeten daarom gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd door iedereen die bekend is met die techniek.
In dit protocol zullen we de techniek beschrijven die wordt gebruikt om luminale ATP te onderzoeken bij vrouwelijke Sprague Dawley-ratten met een gewicht van ongeveer 200-250 g, omdat de hieronder beschreven transurethrale katheterisatie veel gemakkelijker is bij vrouwen; transurethrale katheterisatie kan echter ook worden uitgevoerd bij mannelijke knaagdieren10. Aangezien transurethrale katheterisatie nu is uitgevoerd bij muizen van beide geslachtenen ook 11, kunnen deze experimenten gemakkelijk worden aangepast voor muizen of ratten van beide geslachten of van verschillende grootte, afhankelijk van de behoeften van het onderzoeksteam.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

ATP, vrijgekomen uit het urotheel als reactie op opgezette blaas, wordt verondersteld een belangrijke sensorische rol te spelen bij de controle van mictie. Daarom is nauwkeurige meting van urotheliale ATP-afgifte in een fysiologische omgeving een belangrijke eerste stap in het bestuderen van de mechanismen die purinerge signalering in de urineblaas regelen. Bestaande technieken om mechanisch opgeroepen urotheliale ATP-afgifte te bestuderen, maken gebruik van gekweekte cellen die zijn verguld op flexibele steunen of blaasweefsel dat in ussingkamers is vastgepind; elk van deze technieken emuleert echter niet volledig de omstandigheden in de intacte blaas. Daarom werd een experimentele opstelling ontwikkeld om atp-concentraties direct te meten in het lumen van de urineblaas van knaagdieren.
In deze opstelling worden de blazen van verdoofde knaagdieren door katheters in zowel de koepel van de blaas als via de externe urethrale opening doordrenkt. De druk in de blaas wordt verhoogd door de urethrale katheter af te sluiten en steriele vloeistof via de koepel in de blaas te brengen. Meting van de intravesicale druk wordt bereikt met behulp van een drukomvormer die is bevestigd aan de blaaskoepelkatheter, vergelijkbaar met de opstelling die wordt gebruikt voor cystometrie. Zodra de gewenste druk is bereikt, wordt de dop van de urethrale katheter verwijderd en vloeistof verzameld voor ATP-kwantificering door luciferine-luciferasetest. Door deze experimentele opstelling kunnen de mechanismen die zowel mechanische als chemische stimulatie van urotheliale ATP-afgifte regelen, worden ondervraagd door verschillende agonisten of antagonisten in het perfusaat op te nemen of door resultaten tussen wildtype en genetisch gemodificeerde dieren te vergelijken.

Het beschreven protocol maakt het mogelijk om de urotheliale ATP-afgifte in vivo uit het lumen van de blaas nauwkeurig te meten, met behulp van een aangepaste versie van de standaard cystometrie-opstelling voor knaagdieren (zie figuur 1). Dit stelt de onderzoeker in staat om de effecten van geneesmiddelen op stretch-gemedieerde ATP-afgifte in een fysiologische omgeving te onderzoeken.
<img alt="Figure 1" class="x...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Dit protocol beschrijft de procedure voor het meten van ATP-concentraties in het lumen van de blaas bij een verdoofd knaagdier.

In vivo Luminale meting van Distensie-evoked Urothelial ATP Release bij knaagdieren

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Ons protocol meet ATP, een belangrijke zender in de urineblaas, waarmee we de mechanismen die de afgifte ervan regelen, verder kunnen onderzoeken. Onze techniek meet ATP rechtstreeks vanuit het blaaslumen, waardoor het fysiologisch relevanter is dan technieken met gekweekte cellen of blaasweefsel. Keara Healy en Stephanie Daugherty, onderzoekstechnici in mijn laboratorium, demonstreren de procedure.Om te beginnen, induceer initiële anesthesie door het dier in een gesloten doos te plaatsen die is vergast met 4% tot 5% isofluraan in zuurstof. Dien subcutaan bilateraal urethaan toe en plaats het dier vervolgens in een kooi om het urethaan bijna twee uur in werking te laten treden. Nadat u hebt gewacht tot het urethaan effect heeft, test u op een goed niveau van anesthesie door de voet van het dier te knijpen met behulp van een tang.Om de samentrekking van de blaas als reactie op uitzetting tijdens het experiment te voorkomen, injecteert u het dier met een ganglionisch blokkerend middel, hexamethonium. Breng vervolgens oogheelkundige zalf aan op de ogen van het dier om uitdroging tijdens het experiment te voorkomen. Scheer nu de buik van het dier en voer een middenlijn laparotomie uit om de urineblaas bloot te leggen.Gebruik een vlam om het ene uiteinde van een korte lengte pe50 intramedische buis af te vuren, plaats een naald van 22 gauge in het andere uiteinde van de buis en vul deze met Krebs-oplossing. Plaats een kleine lus van 3-0 zijdeverbinding over de koepel van de blaas en voer een kleine cystostoma uit om het uitlopende uiteinde van de katheter in te brengen. Terwijl u de katheter met één hand vasthoudt, spant u de hechtlus aan om de katheter met de andere hand op zijn plaats te houden.Voltooi het vastzetten van de katheter door twee knopen in de hechting te binden. Trek de katheter terug totdat de uitlopende kop in contact komt met de blaaswand. Test de opstelling op lekken door een kleine hoeveelheid Krebs-oplossing door de katheter te brengen.Dompel het uiteinde van een iv-katheter in chirurgisch glijmiddel. Houd de uitwendige urethrale meatus voorzichtig vast met een tang en steek de punt van de katheter in de urethrale opening in de richting van de staart, zoals beschreven in het manuscript. Draai de katheter 90 graden en ga voorzichtig vooruit.Plaats de katheter totdat de luer lock hub vijf millimeter distaal is van de externe urethrale opening. Zet de katheter vast en voorkom lekkage rond de katheter door een korte lengte van 3-0 zijden hechtdraad rond de externe urethrale meatus te lusen en stevig af te binden. Bevestig de katheter aan de staart met tape om te voorkomen dat deze per ongeluk wordt uitgetrokken.Eenmaal gekatheteriseerd, injecteer krebs oplossing voorzichtig in de blaas via de suprapubische blaaskatheter en bevestig dat de vloeistof uit de urethrale katheter stroomt en er niet omheen. Sluit de abdominale incisie over de blaas met behulp van een 3-0 zijdeverbinding. Plaats een absorberend onderpad op een verwarmingskussen om de lichaamswarmte te behouden en vloeistof te absorberen.Bevestig het dier op de hellende plank om te helpen bij het afvoeren van intravesicale vloeistof door de urethrale katheter en schakel vervolgens het verwarmingskussen in. Sluit de suprapubische katheter aan op een driewegstopkraan die de katheter verbindt met een spuitpomp en een drukomvormer. Sluit de drukomvormer aan op een computer via een versterker en een data-acquisitiesysteem.Infundeer Krebs-oplossing door de suprapubische katheter met een snelheid van 0,1 milliliter per minuut en laat de vloeistof gedurende één uur door de urethrale katheter lopen om eventuele resterende ATP die vrijkomt tijdens de katheterimplantaties uit te spoelen. Sluit na deze uitwasperiode de urethrale katheter af met een luer lock plug. Meet de druk in de blaas en zoek naar een langzame stijging van de intravesicale druk tot een druk van 30 centimeter water zonder een sterke toename van de druk, wat wijst op een blaascontractie.Verwijder de plug uit de urethrale katheter wanneer de druk 30 centimeter water bereikt om schade aan de blaas te voorkomen. Infundeer de blaas en verzamel het eluent uit de urethrale katheter. Test 100 microliter aliquots van het eluent onmiddellijk op ATP of vries in voor latere batchkwantificering.Om het effect van de blaasuitzetting op luminale ATP-concentraties te testen, sluit u de urethrale katheter af met de plug en controleert u de blaasdruk totdat deze het gewenste niveau bereikt, maakt u vervolgens de urethrale katheter los en verzamelt u het eluent voor ATP-meting of bevriezing, zoals hierboven beschreven. Laat na elke uitzetting de blaas rusten en uitspoelen gedurende 10 tot 15 minuten voordat u extra monsters neemt. Om het effect van geneesmiddelen op de afgifte van ATP te testen, schakelt u de Krebs-oplossing die de blaas infundeert over op Krebs die het medicijn van keuze bevatten.Perfuseer het medicijn gedurende 10 tot 15 minuten om een effect te hebben en verzamel vervolgens de monsters van niet-opgezwollen en opgezwollen blazen, zoals eerder aangetoond. Plaats 100 microliter monster perfusaat met 50 microliter van de testmix in de luminometer voor aflezing. Om van relatieve lichteenheden naar ATP-concentratie om te zetten, maakt u seriële verdunningen van ATP in Krebs-oplossing, variërend van één micromolair tot 10 picomolair in tienvoudige verdunningen om een standaardcurve te creëren en leest u deze in de luminometer.Plot de resulterende metingen op een grafiek en voer een niet-lineaire regressie uit om concentraties van de monsters van het dier te extrapoleren. Infusie van de oplossing in de blaas terwijl de urethrale katheter is aangesloten, zorgt ervoor dat de intravesicale druk sterk stijgt naarmate de blaas samentrekt. Na toediening van hexamethonium werd een meer geleidelijke stijging van de intravesicale druk waargenomen, waardoor de druk zonder contractie tot 30 centimeter water kon stijgen.Briljantblauw FCF verlaagt de helling van de standaardcurve aanzienlijk, voldoende om de berekende waarden voor de atpconcentratie in het monster te wijzigen. Het berekenen van de concentratie van ATP in een monster met behulp van de Krebs-standaard die briljantblauwe FCF bevat, kan resulteren in een onderschatting van de ATP-concentratie met 50% Uitzetting van de blaas verhoogt luminale ATP-concentraties, die kunnen worden verminderd in de aanwezigheid van NTPDase-apvrase, of verhoogd wanneer endogene NTPD ACE's worden geremd met ARL67156. De stretch-geïnduceerde ATP-afgifte uit het urotheel werd geanalyseerd.Distensie-opgeroepen ATP-afgifte wordt geblokkeerd door de panectinkanaalantagonisten, briljantblauwe FCF en carbonoxolon, maar niet met een connexonkanaalantagonist, 18 alfa-glycyrrhetininezuur. Het is absoluut noodzakelijk dat alle luminometermetingen worden omgezet in concentraties van ATP met behulp van de juiste standaardcurve, omdat de Lucifer Luciferase-reactie zeer gevoelig is voor interferentie door een breed scala aan verschillende middelen. Onze techniek kan worden gebruikt om de door distensie opgewekte afgifte van elk molecuul in het lumen van de blaas te bestuderen, ervan uitgaande dat er een geschikte test voor dat molecuul bestaat.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI voor mobiele Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Slow-release Drug Delivery via Elvax 40W aan de Rat Retina: Implicaties voor de behandeling van chronische voorwaarden

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Remote Limb Ischemische preconditionering: Een Neurobeschermende Technique in Knaagdieren

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intra-uteriene Telemetrie naar Mouse Contractiele druk te meten<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transcutane beoordeling van de nierfunctie in Conscious Knaagdieren

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Voorbereiding stappen voor meting van reactiviteit in muis retinale arteriolen Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Met behulp van een chemische biopsie voor Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...