Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) à JMB (DK117884).

Toutes les procédures effectuées chez les rongeurs doivent respecter les lignes directrices applicables et être approuvées par le comité d’éthique de l’établissement local. Les expériences réalisées pour ce manuscrit ont été réalisées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals du Conseil national de recherches du Canada et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la faculté de médecine de l’Université de Pittsburgh. Voir la <strong class="xfi...

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

La majorité des recherches sur la libération d’ATP urothéliale sont menées dans des cellules en culture, en utilisant soit des lignées cellulaires immortalisées, soit des cultures primaires de cellules urothéliales de rongeurs. Bien que ces modèles aient l’avantage d’avoir un débit relativement élevé (c.-à-d. qu’une culture ou un passage peut faire de nombreuses assiettes/boîtes de cellules), leur pertinence physiologique est diminuée en raison : 1) de l’incapacité des cellules urothéliales à s...

On pense que l’ATP urinaire joue un rôle sensoriel important dans le contrôle de la miction1. Par exemple, on pense que l’ATP est libéré de l’urothélium en réponse à la distension où il peut agir sur les récepteurs des nerfs afférents de la vessie pour augmenter leur excitabilité, conduisant à des sensations de plénitude2. Ainsi, on pense également que l’ATP urinaire pourrait être un acteur important dans le développement des pathologies de la vessie. À l’appui de cette hypothèse, les concentrations urinaires d’ATP sont significativement augmentées chez les patients souffrant d’hyperactivité vésicale (vessie hyperactive)3, de syndrome de douleur vésicale/cystite interstitielle (SPB/IC)4 ou d’infection des voies urinaires (IVU)5,6, toutes conditions caractérisées par une urgence, une fréquence et, parfois, une douleur accrues. À l’inverse, il a été démontré que les patients souffrant de vessie sous-active (UAB), qui se caractérise par une incapacité à vider sa vessie et peut parfois inclure une diminution de la capacité à sentir la plénitude de la vessie, ont diminué les concentrations urinairesd’ATP 7. Expérimentalement, la manipulation des concentrations urinaires d’ATP peut modifier les réflexes vésicaux chez le rat; l’augmentation des concentrations d’ATP en bloquant les ATPases endogènes dans la lumière de la vessie peut augmenter la fréquence de miction, tandis que la diminution des concentrations d’ATP en instillant des ATPases exogènes dans la vessie réduit la fréquence de miction8. Ainsi, l’importance de l’ATP urinaire pour la fonction de la vessie est claire.
Compte tenu de l’importance apparente de l’ATP urinaire pour la pathologie de la vessie, la mesure précise de la libération d’ATP urothéliale est une étape importante dans la compréhension des mécanismes qui contrôlent la libération. De nombreuses études ont été réalisées en utilisant différents modèles expérimentaux pour mesurer la libération d’ATP urothéliale. Au premier rang d’entre eux sont les cultures cellulaires, soit des cultures primaires, soit des lignées cellulaires. Cependant, l’utilisation de cellules urothéliales en culture est compliquée par le fait que les cellules urothéliales ne prennent pas leur morphologie polarisée physiologique à moins qu’elles ne soient cultivées sur des membranes perméables spéciales (telles que la technologie Transwell [inserts de puits])9. Ainsi, il est difficile de relier une libération d’ATP mesurée à la physiologie. Les cellules urothéliales cultivées sur des inserts de puits peuvent se polariser et former une barrière semblable à ce que l’on voit in vivo; Cependant, la croissance d’un urothélium complètement différencié peut prendre des jours ou des semaines. De plus, bien qu’il soit possible de monter des inserts de puits dans une chambre d’Ussing et d’appliquer une pression sur le côté apical pour provoquer un étirement, il est difficile d’appliquer une pression suffisante pour imiter les conditions à l’intérieur de la vessie pendant la pathologie (c.-à-d. pressions de 30 cm H2O ou plus). Le tissu entier de la vessie peut également être monté dans une chambre d’Ussing pour des expériences d’étirement, mais cela élimine la vessie de l’organisme ainsi que les facteurs trophiques maintenant la santé des cellules urothéliales et, par conséquent, la fonction de barrière urothéliale. Par conséquent, la façon la plus physiologiquement pertinente d’étudier la libération d’ATP par l’urothélium en réponse à l’étirement ou à la pression est in vivo. Les techniques chirurgicales nécessaires à la mise en place de l’expérience sont identiques à celles couramment utilisées en cystométrie animale et, par conséquent, devraient être facilement effectuées par toute personne familière avec cette technique.
Dans ce protocole, nous décrirons la technique utilisée pour examiner l’ATP luminal chez les rats Sprague Dawley femelles pesant environ 200-250 g, car le cathétérisme transurétral décrit ci-dessous est beaucoup plus facile chez les femelles; Cependant, le cathétérisme transurétral peut également être effectué chez les rongeurs mâles10. Comme le cathétérisme transurétral a maintenant été effectué chez des souris des deux sexes11, ces expériences peuvent facilement être adaptées à des souris ou des rats des deux sexes ou de tailles variables, selon les besoins de l’équipe de recherche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

On pense que l’ATP, libéré par l’urothélium en réponse à la distension de la vessie, joue un rôle sensoriel important dans le contrôle de la miction. Par conséquent, la mesure précise de la libération d’ATP urothéliale dans un contexte physiologique est une première étape importante dans l’étude des mécanismes qui contrôlent la signalisation purinergique dans la vessie. Les techniques existantes pour étudier la libération d’ATP urothéliale évoquée mécaniquement utilisent des cellules cultivées plaquées sur des supports flexibles ou des tissus vésicaux épinglés dans des chambres d’Ussing; Cependant, chacune de ces techniques n’imite pas complètement les conditions dans la vessie intacte. Par conséquent, une installation expérimentale a été développée pour mesurer directement les concentrations d’ATP dans la lumière de la vessie des rongeurs.
Dans cette configuration, les vessies des rongeurs anesthésiés sont perfusées à travers des cathéters à la fois dans le dôme de la vessie et via l’orifice urétral externe. La pression dans la vessie est augmentée en coiffant le cathéter urétral tout en perfusant du liquide stérile dans la vessie à travers le dôme. La mesure de la pression intravésicale est réalisée à l’aide d’un transducteur de pression fixé au cathéter à dôme vésical, semblable à la configuration utilisée pour la cystométrie. Une fois la pression désirée atteinte, le capuchon du cathéter urétral est retiré et le liquide prélevé pour la quantification de l’ATP par dosage de la luciférine-luciférase. Grâce à cette configuration expérimentale, les mécanismes contrôlant à la fois la stimulation mécanique et chimique de la libération d’ATP urothéliale peuvent être interrogés en incluant divers agonistes ou antagonistes dans le perfusat ou en comparant les résultats entre les animaux de type sauvage et génétiquement modifiés.

Le protocole décrit permet de mesurer avec précision la libération d’ATP urothéliale in vivo à partir de la lumière de la vessie, en utilisant une version modifiée de la configuration standard de cystométrie des rongeurs (voir Figure 1). Cela permet au chercheur d’examiner les effets des médicaments sur la libération d’ATP à médiation par étirement dans un contexte physiologique.
<img alt="Figu...

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In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Ce protocole décrit la procédure de mesure des concentrations d’ATP dans la lumière de la vessie chez un rongeur anesthésié.

In vivo Mesure luminale de la libération d’ATP urothéliale évoquée par distension chez les rongeurs

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Notre protocole mesure l’ATP, un transmetteur important dans la vessie, ce qui nous permettra d’interroger davantage les mécanismes contrôlant sa libération. Notre technique mesure l’ATP directement à partir de la lumière de la vessie, ce qui la rend plus pertinente physiologiquement que les techniques utilisant des cellules en culture ou du tissu vésical. Keara Healy et Stephanie Daugherty, techniciennes de recherche dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Pour commencer, induisez une anesthésie initiale en plaçant l’animal dans une boîte fermée gazée avec 4% à 5% d’isoflurane dans de l’oxygène. Administrer de l’uréthane par voie sous-cutanée bilatéralement, puis placer l’animal dans une cage pour permettre à l’uréthane de faire effet pendant près de deux heures. Après avoir attendu que l’uréthane fasse effet, testez un plan d’anesthésie approprié en pinçant le pied de l’animal à l’aide d’une pince.Pour éviter la contraction de la vessie en réponse à la distension pendant l’expérience, injectez à l’animal un agent bloquant ganglionnaire, l’hexaméthonium. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement pendant l’expérience. Maintenant, rasez l’abdomen de l’animal et effectuez une laparotomie médiane pour exposer la vessie.À l’aide d’une flamme, évaser une extrémité d’une courte longueur de tube intramédical PE50, placer une aiguille de calibre 22 dans l’autre extrémité du tube et la remplir de solution Krebs. Placez une petite boucle de suture de soie 3-0 sur le dôme de la vessie et effectuez une petite cystostomie pour insérer l’extrémité évasée du cathéter. Tout en tenant le cathéter d’une main, serrez la boucle de suture pour fixer le cathéter en place avec l’autre main.Terminez la fixation du cathéter en attachant deux nœuds dans la suture. Tirez le cathéter vers l’arrière jusqu’à ce que la tête évasée soit en contact avec la paroi de la vessie. Testez la configuration pour détecter les fuites en perfusant une petite quantité de solution de Krebs à travers le cathéter.Trempez l’extrémité d’un cathéter IV dans un lubrifiant chirurgical. Tenez doucement le méat urétral externe avec une paire de pinces et insérez l’extrémité du cathéter dans l’orifice urétral dans la direction de la queue, comme décrit dans le manuscrit. Faites pivoter le cathéter de 90 degrés et avancez doucement.Insérez le cathéter jusqu’à ce que le moyeu de verrouillage luer soit à cinq millimètres distal de l’ouverture urétrale externe. Fixez le cathéter et évitez les fuites autour du cathéter en bouclant une courte longueur de suture de soie 3-0 autour du méat urétral externe et en l’attachant fermement. Fixez le cathéter à la queue avec du ruban adhésif pour éviter qu’il ne soit accidentellement retiré.Une fois le cathétérisme effectué, infuser doucement la solution de Krebs dans la vessie à travers le cathéter vésical sus-pubien et confirmer que le liquide s’écoule hors du cathéter urétral et non autour de celui-ci. Fermez l’incision abdominale sur la vessie à l’aide d’une suture en soie 3-0. Placez un sous-tampon absorbant sur un coussin chauffant pour maintenir la chaleur corporelle et absorber le liquide.Fixez l’animal sur la planche inclinée pour aider à drainer le liquide intravésical à travers le cathéter urétral, puis allumez le coussin chauffant. Connectez le cathéter sus-pubien à un robinet d’arrêt à trois voies reliant le cathéter à une pompe à seringue et à un transducteur de pression. Connectez le transducteur de pression à un ordinateur via un amplificateur et un système d’acquisition de données.Infuser la solution de Krebs à travers le cathéter sus-pubien à un débit de 0,1 millilitre par minute et laisser le liquide s’écouler à travers le cathéter urétral pendant une heure pour éliminer tout résidu d’ATP libéré lors des implantations du cathéter. Après cette période de lavage, boucher le cathéter urétral à l’aide d’un bouchon de verrouillage luer. Mesurez la pression dans la vessie et recherchez une augmentation lente de la pression intravésicale à une pression de 30 centimètres d’eau sans une forte augmentation de la pression, indiquant une contraction de la vessie.Retirez le bouchon du cathéter urétral lorsque la pression atteint 30 centimètres d’eau pour éviter d’endommager la vessie. Infuser la vessie et recueillir l’éluant du cathéter urétral. Tester immédiatement 100 microlitres aliquotes de l’éluant pour l’ATP ou congeler pour une quantification ultérieure du lot.Pour tester l’effet de la distension de la vessie sur les concentrations luminales d’ATP, boucher le cathéter urétral avec le bouchon et surveiller la pression de la vessie jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau souhaité, puis déboucher le cathéter urétral et recueillir l’éluant pour la mesure ou la congélation de l’ATP, comme décrit ci-dessus. Après chaque distension, laissez la vessie se reposer et se laver pendant 10 à 15 minutes avant de prélever des échantillons supplémentaires. Pour tester l’effet des médicaments sur la libération d’ATP, remplacer la solution de Krebs par injection de la vessie par Krebs contenant le médicament de votre choix.Perfuser le médicament pendant 10 à 15 minutes pour avoir un effet, puis prélever les échantillons des vessies non distendues et distendues, comme démontré précédemment. Placez 100 microlitres d’échantillon de perfusat avec 50 microlitres du mélange de dosage dans le luminomètre pour la lecture. Pour convertir les unités légères relatives en concentration d’ATP, effectuer des dilutions en série d’ATP dans une solution de Krebs allant d’une micromolaire à 10 picomolaires dans des dilutions décuplées pour créer une courbe standard, et les lire dans le luminomètre.Tracer les lectures résultantes sur un graphique et effectuer une régression non linéaire pour extrapoler les concentrations à partir des échantillons prélevés sur l’animal. La perfusion de la solution dans la vessie alors que le cathéter urétral est bouché provoque une forte augmentation de la pression intravésicale à mesure que la vessie se contracte. Après l’administration d’hexaméthonium, une augmentation plus progressive de la pression intravésicale a été observée, permettant à la pression d’augmenter jusqu’à 30 centimètres d’eau sans contraction.Le bleu brillant FCF diminue considérablement la pente de la courbe standard, suffisamment pour modifier les valeurs calculées pour la concentration d’ATP dans l’échantillon. Le calcul de la concentration d’ATP dans un échantillon à l’aide de l’étalon de Krebs contenant du bleu brillant FCF peut entraîner une sous-estimation de la concentration d’ATP de 50%La distension de la vessie augmente les concentrations luminales d’ATP, qui peuvent être diminuées en présence de NTPDase apvrase, ou augmentées lorsque les ECA NTPD endogènes sont inhibées par ARL67156. La libération d’ATP induite par l’étirement de l’urothélium a été analysée.La libération d’ATP évoquée par distension est bloquée par les antagonistes du canal panectine, le bleu brillant FCF et la carbonoxolone, mais pas par un antagoniste du canal connexon, l’acide alpha-glycyrrhétinique. Il est impératif que toutes les lectures du luminomètre soient converties en concentrations d’ATP en utilisant la courbe standard appropriée, car la réaction Lucifer Luciferase est très sensible aux interférences d’une grande variété d’agents différents. Notre technique pourrait être utilisée pour étudier la libération évoquée par distension de toute molécule dans la lumière de la vessie, en supposant qu’il existe un dosage approprié pour cette molécule.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

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