Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Nationalen Instituts für Diabetes und Verdauungs- und Nierenerkrankungen (NIDDK) an JMB (DK117884) unterstützt.

Alle Verfahren, die an Nagetieren durchgeführt werden, müssen den geltenden Richtlinien entsprechen und von der lokalen institutionellen Ethikkommission genehmigt werden. Die Experimente, die für dieses Manuskript durchgeführt wurden, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden des National Research Council für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh School of Medicine genehmigt. In Abbildun...

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Der Großteil der Forschung zur Urothel-ATP-Freisetzung wird in kultivierten Zellen durchgeführt, wobei entweder immortalisierte Zelllinien oder Primärkulturen von Nagetier-Urothelzellen verwendet werden. Während diese Modelle den Vorteil haben, dass sie einen relativ hohen Durchsatz haben (d.h. eine Kultur / Passage kann viele Platten / Schalen von Zellen bilden), wird ihre physiologische Relevanz verringert durch: 1) die Unfähigkeit von Urothelzellen, polarisiert zu wachsen, es sei denn, sie werden auf speziellen T...

Es wird angenommen, dass ATP im Urin eine wichtige sensorische Rolle bei der Kontrolle der Miktion spielt1. Zum Beispiel wird angenommen, dass ATP aus dem Urothel als Reaktion auf Dehnung freigesetzt wird, wo es auf Rezeptoren auf blasenafferente Nerven wirken kann, um ihre Erregbarkeit zu erhöhen, was zu Sättigungsgefühlen führt2. Daher wird auch angenommen, dass ATP im Urin ein wichtiger Akteur bei der Entwicklung von Blasenpathologien sein könnte. Zur Unterstützung dieser Hypothese sind die ATP-Konzentrationen im Urin bei Patienten mit überaktiver Blase (OAB)3, Blasenschmerzsyndrom/interstitieller Zystitis (BPS/IC)4 oder einer Harnwegsinfektion (UTI)5,6 signifikant erhöht, alles Zustände, die durch erhöhte Dringlichkeit, Häufigkeit und manchmal Schmerzen gekennzeichnet sind. Umgekehrt wurde bei Patienten, die an einer Unterfunktion der Blase (UAB) leiden, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, die Blase zu entleeren, und die manchmal eine verminderte Fähigkeit zur Wahrnehmung der Blasenfülle aufweisen kann, eineverminderte ATP-Konzentration im Urin nachgewiesen 7. Experimentell kann die Manipulation der ATP-Konzentrationen im Urin die Blasenreflexe bei der Ratte verändern. Die Erhöhung der ATP-Konzentrationen durch die Blockierung endogener ATPasen im Blasenlumen kann die Blasenentleerungshäufigkeit erhöhen, während die Verringerung der ATP-Konzentrationen durch Einträufeln exogener ATPasen in die Blase die Blasenentleerungshäufigkeit verringert8. Somit ist die Bedeutung von ATP im Urin für die Blasenfunktion klar.
Angesichts der offensichtlichen Bedeutung von ATP im Urin für die Pathologie der Blase ist die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Mechanismen, die die Freisetzung kontrollieren. Viele Studien wurden mit verschiedenen experimentellen Modellen durchgeführt, um die Urothel-ATP-Freisetzung zu messen. An erster Stelle stehen dabei Zellkulturen, entweder Primärkulturen oder Zelllinien. Die Verwendung von kultivierten Urothelzellen wird jedoch durch die Tatsache erschwert, dass Urothelzellen ihre physiologisch polarisierte Morphologie nur annehmen, wenn sie auf speziellen durchlässigen Membranen gezüchtet werden (z. B. Transwell-Technologie [Well-Inserts])9. Daher ist es schwierig, eine gemessene ATP-Freisetzung mit der Physiologie in Verbindung zu bringen. Urothelzellen, die auf Well-Inserts gezüchtet werden, können polarisieren und eine Barriere bilden, die dem ähnelt, was in vivo beobachtet wird. Das Wachstum eines vollständig differenzierten Urothels kann jedoch Tage oder Wochen dauern. Während es möglich ist, gut eingesetzte Einsätze in einer Ussing-Kammer zu montieren und Druck auf die apikale Seite auszuüben, um eine Dehnung zu verursachen, ist es schwierig, genügend Druck auszuüben, um die Bedingungen in der Blase während der Pathologie nachzuahmen (d.h. Drücke von 30 cm H2O oder höher). Ganzes Blasengewebe kann auch in einer Ussing-Kammer für Dehnungsexperimente montiert werden, aber dies entfernt die Blase aus dem Organismus zusammen mit den trophischen Faktoren, die die Gesundheit der Urothelzellen und damit die Funktion der Urothelbarriere aufrechterhalten. Daher ist der physiologisch relevanteste Weg, um die Freisetzung von ATP aus dem Urothel als Reaktion auf Dehnung oder Druck zu untersuchen, in vivo. Die chirurgischen Techniken, die für den Aufbau des Experiments erforderlich sind, sind identisch mit denen, die üblicherweise in der Zystometrie bei Tieren verwendet werden, und sollten daher von jedem, der mit dieser Technik vertraut ist, leicht durchgeführt werden können.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Technik, die zur Untersuchung von luminalem ATP bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200-250 g verwendet wird, da die unten beschriebene transurethrale Katheterisierung bei Weibchen viel einfacher ist. Die transurethrale Katheterisierung kann jedoch auch bei männlichen Nagetierendurchgeführt werden 10. Da nun auch bei Mäusen beiderlei Geschlechts eine transurethrale Katheterisierung durchgeführt wurde11, können diese Experimente leicht an Mäuse oder Ratten beiderlei Geschlechts oder unterschiedlicher Größe angepasst werden, je nach den Bedürfnissen des Forschungsteams.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

Es wird angenommen, dass ATP, das als Reaktion auf eine Blasendehnung aus dem Urothel freigesetzt wird, eine wichtige sensorische Rolle bei der Kontrolle der Miktion spielt. Daher ist die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung in einem physiologischen Umfeld ein wichtiger erster Schritt bei der Untersuchung der Mechanismen, die die purinerge Signalübertragung in der Harnblase steuern. Bestehende Techniken zur Untersuchung der mechanisch evozierten Urothel-ATP-Freisetzung verwenden kultivierte Zellen, die auf flexiblen Trägern oder Blasengewebe in Ussing-Kammern fixiert sind. Jede dieser Techniken ahmt jedoch die Bedingungen in der intakten Blase nicht vollständig nach. Daher wurde ein Versuchsaufbau entwickelt, um ATP-Konzentrationen im Lumen der Harnblase von Nagetieren direkt zu messen.
In diesem Aufbau werden die Blasen von anästhesierten Nagetieren durch Katheter sowohl in der Blasenkuppel als auch über die äußere Harnröhrenöffnung perfundiert. Der Druck in der Blase wird erhöht, indem der Harnröhrenkatheter verschlossen wird, während sterile Flüssigkeit durch die Kuppel in die Blase geleitet wird. Die Messung des intravesikalen Drucks erfolgt mit einem Druckwandler, der am Blasendomkatheter befestigt ist, ähnlich dem für die Zystometrie verwendeten Aufbau. Sobald der gewünschte Druck erreicht ist, wird die Kappe des Harnröhrenkatheters entfernt und Flüssigkeit für die ATP-Quantifizierung durch Luciferin-Luciferase-Assay gesammelt. Durch diesen Versuchsaufbau können die Mechanismen, die sowohl die mechanische als auch die chemische Stimulation der Urothel-ATP-Freisetzung steuern, untersucht werden, indem verschiedene Agonisten oder Antagonisten in das Perfusat aufgenommen oder die Ergebnisse zwischen Wildtyp- und genetisch veränderten Tieren verglichen werden.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung in vivo aus dem Lumen der Blase unter Verwendung einer modifizierten Version des Standard-Nagetier-Zystometrie-Setups (siehe Abbildung 1). Dies ermöglicht es dem Forscher, die Auswirkungen von Medikamenten auf die dehnungsvermittelte ATP-Freisetzung in einem physiologischen Umfeld zu untersuchen.
<img alt="Figure 1" class="xfig...

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In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Messung von ATP-Konzentrationen im Lumen der Blase bei einem anästhesierten Nagetier.

Im lebenden Organismus Luminale Messung der durch Dehnung hervorgerufenen urothhelialen ATP-Freisetzung bei Nagetieren

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Unser Protokoll misst ATP, einen wichtigen Übermittler in der Harnblase, der es uns ermöglicht, die Mechanismen, die seine Freisetzung steuern, weiter zu untersuchen. Unsere Technik misst ATP direkt aus dem Blasenlumen und ist damit physiologisch relevanter als Techniken, bei denen kultivierte Zellen oder Blasengewebe verwendet werden. Keara Healy und Stephanie Daugherty, Forschungstechniker in meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren.Induzieren Sie zunächst eine Erstanästhesie, indem Sie das Tier in eine geschlossene Box legen, die mit 4% bis 5% Isofluran in Sauerstoff begast ist. Verabreichen Sie Urethan beidseitig subkutan und legen Sie das Tier dann in einen Käfig, damit das Urethan fast zwei Stunden lang wirken kann. Nachdem Sie darauf gewartet haben, dass das Urethan wirkt, testen Sie auf eine geeignete Anästhesieebene, indem Sie den Fuß des Tieres mit einer Pinzette einklemmen.Um die Kontraktion der Blase als Reaktion auf Dehnung während des Versuchs zu verhindern, injizieren Sie dem Tier ein ganglionäres Blockermittel, Hexamethonium. Als nächstes tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen während des Experiments zu verhindern. Rasieren Sie nun den Bauch des Tieres und führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie durch, um die Harnblase freizulegen.Flammen Sie mit einer Flamme ein Ende einer kurzen Länge des PE50-Intramedizinschlauchs auf, legen Sie eine 22-Gauge-Nadel in das andere Ende des Schlauchs und füllen Sie sie mit Krebslösung. Legen Sie eine kleine Schleife aus 3-0 Seidennaht über die Blasenkuppel und führen Sie eine kleine Zystostomie durch, um das ausgestellte Ende des Katheters einzuführen. Während Sie den Katheter mit einer Hand halten, ziehen Sie die Nahtschlaufe fest, um den Katheter mit der anderen Hand an Ort und Stelle zu halten.Beenden Sie die Sicherung des Katheters, indem Sie zwei Knoten in der Naht binden. Ziehen Sie den Katheter zurück, bis der ausgestellte Kopf in Kontakt mit der Blasenwand ist. Testen Sie das Setup auf Lecks, indem Sie eine kleine Menge Krebslösung durch den Katheter injizieren.Tauchen Sie das Ende eines intravenösen Katheters in chirurgisches Gleitmittel. Halten Sie den äußeren Meatus urethralis vorsichtig mit einer Pinzette und führen Sie die Spitze des Katheters in die Harnröhrenöffnung in Richtung des Schwanzes ein, wie im Manuskript beschrieben. Drehen Sie den Katheter um 90 Grad und bewegen Sie sich vorsichtig vorwärts.Führen Sie den Katheter ein, bis die Luer-Lock-Nabe fünf Millimeter von der äußeren Harnröhrenöffnung entfernt ist. Sichern Sie den Katheter und verhindern Sie ein Auslaufen um den Katheter, indem Sie eine kurze 3-0-Seidennaht um den äußeren Harnröhrenfleisch schlingen und fest abbinden. Befestigen Sie den Katheter mit Klebeband am Schwanz, um zu verhindern, dass er versehentlich herausgezogen wird.Nach der Katheterisierung wird die Krebslösung vorsichtig durch den suprapubischen Blasenkatheter in die Blase infundiert und bestätigt, dass die Flüssigkeit aus dem Harnröhrenkatheter und nicht um ihn herum fließt. Schließen Sie den Bauchschnitt über der Blase mit einer 3-0 Seidennaht. Legen Sie eine saugfähige Unterlage auf ein Heizkissen, um die Körperwärme zu halten und Flüssigkeit aufzunehmen.Befestigen Sie das Tier auf dem geneigten Brett, um die intravesikale Flüssigkeit durch den Harnröhrenkatheter abzulassen, und schalten Sie dann das Heizkissen ein. Verbinden Sie den suprapubischen Katheter mit einem Dreiwege-Stopphahn, der den Katheter mit einer Spritzenpumpe und einem Druckaufnehmer verbindet. Schließen Sie den Druckmessumformer über einen Verstärker und ein Datenerfassungssystem an einen Computer an.Infusion von Krebslösung durch den suprapubischen Katheter mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Milliliter pro Minute und lassen Sie die Flüssigkeit eine Stunde lang durch den Harnröhrenkatheter abfließen, um das bei den Katheterimplantationen freigesetzte restliche ATP auszuwaschen. Nach dieser Auswaschphase verschließen Sie den Harnröhrenkatheter mit einem Luer-Lock-Stopfen. Messen Sie den Druck in der Blase und suchen Sie nach einem langsamen Anstieg des intravesikalen Drucks auf einen Druck von 30 Zentimetern Wasser ohne starken Druckanstieg, was auf eine Blasenkontraktion hinweist.Entfernen Sie den Pfropfen aus dem Harnröhrenkatheter, wenn der Druck 30 Zentimeter Wasser erreicht, um eine Schädigung der Blase zu vermeiden. Infundieren Sie die Blase und sammeln Sie das Elutionsmittel aus dem Harnröhrenkatheter. Testen Sie 100 Mikroliter-Aliquots des Eluenten sofort auf ATP oder frieren Sie es für eine spätere Chargenquantifizierung ein.Um die Wirkung der Blasendehnung auf luminale ATP-Konzentrationen zu testen, verschließen Sie den Harnröhrenkatheter mit dem Stöpsel und überwachen Sie den Blasendruck, bis er das gewünschte Niveau erreicht, lösen Sie dann den Harnröhrenkatheter und sammeln Sie das Elutionsmittel für die ATP-Messung oder das Einfrieren, wie oben beschrieben. Lassen Sie die Blase nach jeder Dehnung 10 bis 15 Minuten ruhen und auswaschen, bevor Sie weitere Proben entnehmen. Um die Wirkung von Medikamenten auf die Freisetzung von ATP zu testen, wechseln Sie die Krebslösung, die die Blase infundiert, auf Krebs, der das Medikament der Wahl enthält.Perfundierten Sie das Medikament für 10 bis 15 Minuten, um eine Wirkung zu erzielen, und sammeln Sie dann die Proben aus nicht aufgeblähten und aufgeblähten Blasen, wie zuvor gezeigt. Geben Sie 100 Mikroliter Perfusatprobe mit 50 Mikrolitern der Assay-Mischung in das Luminometer zum Ablesen. Um von relativen leichten Einheiten in die ATP-Konzentration umzurechnen, machen Sie serielle Verdünnungen von ATP in Krebs-Lösung im Bereich von einem Mikromolar bis 10 Picomolar in zehnfachen Verdünnungen, um eine Standardkurve zu erstellen, und lesen Sie sie im Luminometer ab.Zeichnen Sie die resultierenden Messwerte in einem Diagramm auf und führen Sie eine nichtlineare Regression durch, um die Konzentrationen aus den Proben des Tieres zu extrapolieren. Die Infusion der Lösung in die Blase, während der Harnröhrenkatheter verstopft ist, führt dazu, dass der intravesikale Druck stark ansteigt, wenn sich die Blase zusammenzieht. Nach der Verabreichung von Hexamethonium wurde ein allmählicher Anstieg des intravesikanischen Drucks beobachtet, so dass der Druck ohne Kontraktion auf bis zu 30 Zentimeter Wasser ansteigen konnte.Brillantblau FCF verringert die Steigung der Standardkurve erheblich, was ausreicht, um die berechneten Werte für die ATP-Konzentration in der Probe zu ändern. Die Berechnung der ATP-Konzentration in einer Probe unter Verwendung des Krebs-Standards, der brillantblaues FCF enthält, kann zu einer Unterschätzung der ATP-Konzentration um 50% führen. Die Dehnung der Blase erhöht die luminalen ATP-Konzentrationen, die in Gegenwart von NTPDase-Apvrase verringert oder erhöht werden können, wenn endogene NTPD-ACEs mit ARL67156 gehemmt werden. Die dehnungsinduzierte ATP-Freisetzung aus dem Urothel wurde analysiert.Die durch Dehnung hervorgerufene ATP-Freisetzung wird durch die Panectinkanal-Antagonisten, Brillantblau FCF und Carbonoxolon blockiert, nicht jedoch durch einen Connexon-Kanal-Antagonisten, 18-Alpha-Glycyrrhetinsäure. Es ist zwingend erforderlich, dass alle Luminometerwerte unter Verwendung der entsprechenden Standardkurve in ATP-Konzentrationen umgerechnet werden, da die Lucifer-Luciferase-Reaktion sehr anfällig für Störungen durch eine Vielzahl verschiedener Wirkstoffe ist. Unsere Technik könnte verwendet werden, um die durch Dehnung hervorgerufene Freisetzung eines Moleküls im Lumen der Blase zu untersuchen, vorausgesetzt, dass ein geeigneter Assay für dieses Molekül existiert.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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