Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK) ל- JMB (DK117884).

כל ההליכים המבוצעים במכרסמים חייבים לעמוד בהנחיות הרלוונטיות ולקבל את אישור ועדת האתיקה המוסדית המקומית. הניסויים שבוצעו עבור כתב יד זה בוצעו בהתאם למדריך המועצה הלאומית למחקר לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית הספר לרפואה של אוני...

<ol>
	<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+urinary+tract+in+health+and+disease.">Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease.</a> Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Autonomic Neuroscience: Basic &amp; Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).</li><li>Silva-Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+may+be+a+dynamic+biomarker+of+detrusor+overactivity+in+women+with+overactive+bladder+syndrome.">Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome.</a> PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).</li><li>Sun, Y., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+extracellular+ATP+signaling+in+bladder+urothelial+cells+from+patients+with+interstitial+cystitis.">Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).</li><li>Gill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+as+an+indicator+of+infection+and+inflammation+of+the+urinary+tract+in+patients+with+lower+urinary+tract+symptoms.">Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms.</a> BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).</li><li>S&#228;ve, S., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+and+P2Y+receptor+activation+induce+a+proinflammatory+host+response+in+the+human+urinary+tract.">Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).</li><li>Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overactive+and+underactive+bladder+dysfunction+is+reflected+by+alterations+in+urothelial+ATP+and+NO+release.">Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release.</a> Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).</li><li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder.">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).</li><li>Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+long-term+culture+of+differentiated+normal+rat+urothelial+cells+in+vitro.">Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).</li><li>Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+instillation+procedure+in+adult+male+mouse.">Transurethral instillation procedure in adult male mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).</li><li>Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+in+a+small+animal+model:+Transurethral+catheterization+of+male+and+female+mice.">Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).</li><li>Uvin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cystometry+in+small+rodents:+a+study+of+bladder+chemosensation.">The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).</li><li>Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+oxidation+of+luciferin+without+luciferase+and+the+mechanism+of+bioluminescence.">Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence.</a> Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

רוב המחקר על שחרור ATP בדרכי השתן מתבצע בתאים בתרבית, תוך שימוש בקווי תאים אימורטליים או בתרביות ראשוניות של תאי השתן של מכרסמים. בעוד שלמודלים אלה יש את היתרון של תפוקה גבוהה יחסית (כלומר, תרבית/מעבר אחד יכול לייצר צלחות/כלים רבים של תאים), הרלוונטיות הפיזיולוגית שלהם פוחתת בגלל: 1) חוסר היכו?...

ATP בשתן נחשב כבעל תפקיד תחושתי משמעותי בשליטה על מיקטוריציה1. לדוגמה, הוא חשב כי ATP משתחרר מן השתן בתגובה distension שבו הוא יכול לפעול על קולטנים על עצבים afferent שלפוחית השתן כדי להגביר את ההתרגשות שלהם, מה שמוביל לתחושות של מלאות2. לכן, הוא חשב גם כי ATP בשתן יכול להיות שחקן חשוב בפיתוח פתולוגיות שלפוחית השתן. לתמיכה בהשערה זו, ריכוזי ATP בשתן עולים באופן משמעותי בחולים הסובלים מפעילות יתר של שלפוחית השתן (OAB)3, תסמונת כאב בשלפוחית השתן/דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית (BPS/IC)4, או דלקת בדרכי השתן (UTI)5,6, כולם מצבים המאופיינים בדחיפות מוגברת, בתדירות ולפעמים גם בכאב. לעומת זאת, מטופלים הסובלים מתת-פעילות של שלפוחית השתן (UAB), המאופיינת בחוסר יכולת לרוקן את שלפוחית השתן ולעיתים יכולה לכלול ירידה ביכולת לחוש מלאות בשלפוחית השתן, הוכחו כבעלי ירידה בריכוזי ATP בשתן7. באופן ניסיוני, מניפולציה של ריכוזי ATP בשתן יכולה לשנות את רפלקסי שלפוחית השתן בחולדה; הגדלת ריכוזי ATP על ידי חסימת ATPases אנדוגניים בלומן שלפוחית השתן יכולה להגביר את תדירות ההתרוקנות, בעוד הפחתת ריכוזי ATP על ידי החדרת ATPases אקסוגניים לשלפוחית השתן מפחיתה את תדירות ההתרוקנות8. לפיכך, החשיבות של ATP בשתן לתפקוד שלפוחית השתן ברורה.
בהתחשב בחשיבות לכאורה של ATP בשתן לפתולוגיה של שלפוחית השתן, מדידה מדויקת של שחרור ATP דרכי השתן היא צעד חשוב בהבנת המנגנונים השולטים בשחרור. מחקרים רבים הושלמו תוך שימוש במודלים ניסיוניים שונים למדידת שחרור ATP אורותלי. בראש ובראשונה תרביות תאים, תרביות ראשוניות או קווי תאים. עם זאת, השימוש בתאי שתן בתרבית מסובך בשל העובדה שתאי השתן אינם מקבלים את המורפולוגיה המקוטבת הפיזיולוגית שלהם אלא אם כן הם גדלים על ממברנות חדירות מיוחדות (כגון טכנולוגיית Transwell [תוספות באר])9. לכן, קשה לקשר כל שחרור ATP שנמדד לפיזיולוגיה. תאי השתן הגדלים על תוספות באר יכולים לקטב וליצור מחסום דומה למה שנראה in vivo; עם זאת, הצמיחה של אורותל ממוין לחלוטין יכולה להימשך ימים או שבועות. בנוסף, בעוד שניתן להרכיב היטב מוכנסים לתוך תא שימוש ולהפעיל לחץ על הצד האפי כדי לגרום למתיחה, קשה להפעיל מספיק לחץ כדי לחקות את התנאים בתוך שלפוחית השתן במהלך הפתולוגיה (כלומר, לחצים של 30 ס"מ H2O ומעלה). רקמת שלפוחית השתן כולה יכולה גם להיות מורכבת בתא שימוש לניסויי מתיחה, אך זה מסיר את שלפוחית השתן מהאורגניזם יחד עם הגורמים הטרופיים השומרים על בריאות תאי השתן, ומכאן, תפקוד מחסום השתן. לכן, הדרך הרלוונטית ביותר מבחינה פיזיולוגית לחקור את שחרורו של ATP מהאורותל בתגובה למתיחה או לחץ היא in vivo. הטכניקות הכירורגיות הדרושות להקמת הניסוי זהות לאלה הנפוצות בציסטומטריה של בעלי חיים, ולכן צריכות להתבצע בקלות על ידי כל מי שמכיר את הטכניקה הזו.
בפרוטוקול זה, נתאר את הטכניקה המשמשת לבדיקת ATP לומינלי בחולדות Sprague Dawley נקבות השוקלות כ-200-250 גרם, שכן הצנתור הטרנס-שופכתי המתואר להלן קל הרבה יותר בנקבות; עם זאת, צנתור transurethral יכול להתבצע גם מכרסמים זכרים10. מכיוון שצנתור דרך השופכה בוצע כעת גם בעכברים משני המינים11, ניתן להתאים ניסויים אלה בקלות לעכברים או חולדות משני המינים או בגדלים שונים, בהתאם לצרכי צוות המחקר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

ATP, המשתחרר מהאורותל בתגובה להתנפחות שלפוחית השתן, נחשב כבעל תפקיד תחושתי משמעותי בשליטה על מיקוריטיון. לכן, מדידה מדויקת של שחרור ATP במערכת פיזיולוגית היא צעד ראשון חשוב בחקר המנגנונים השולטים באיתות פורינרגי בשלפוחית השתן. טכניקות קיימות לחקר שחרור ATP אורותלי מעורר מכנית משתמשות בתאים בתרבית המצופים על תמיכות גמישות או ברקמת שלפוחית השתן המוצמדת לתאי שימוש; עם זאת, כל אחת מהטכניקות הללו אינה מחקה באופן מלא את התנאים בשלפוחית השתן השלפוחית. לכן, פותח מערך ניסיוני למדידה ישירה של ריכוזי ATP בלומן של שלפוחית השתן של המכרסם.
במערך זה, שלפוחיות של מכרסמים מורדמים מחוררות דרך צנתרים הן בכיפת שלפוחית השתן והן דרך פתח השופכה החיצוני. הלחץ בשלפוחית השתן מוגבר על ידי סגירת קטטר השופכה תוך החדרת נוזל סטרילי לשלפוחית השתן דרך הכיפה. מדידת הלחץ התוך-שלפוחית מתבצעת באמצעות מתמר לחץ המחובר לצנתר כיפת שלפוחית השתן, בדומה למערך המשמש לציסטומטריה. ברגע שמגיעים ללחץ הרצוי, מכסת צנתר השופכה מוסרת, ונוזל נאסף לכימות ATP על ידי בדיקת לוציפרין-לוציפראז. באמצעות מערך ניסוי זה, ניתן לחקור את המנגנונים השולטים הן בגירוי מכני והן בגירוי כימי של שחרור ATP אורותל על ידי הכללת אגוניסטים או אנטגוניסטים שונים לתוך הפרבוסט או על ידי השוואת התוצאות בין חיות בר לבעלי חיים מהונדסים גנטית.

הפרוטוקול המתואר מאפשר מדידה מדויקת של שחרור ATP בדרכי השתן in vivo מלומן שלפוחית השתן, באמצעות גרסה שונה של מערך הציסטומטריה הסטנדרטי של מכרסמים (ראו איור 1). זה מאפשר לחוקר לבחון את ההשפעות של תרופות על שחרור ATP בתיווך מתיחה בסביבה פיזיולוגית.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-togethe...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

פרוטוקול זה מתאר את ההליך למדידת ריכוזי ATP בלומן של שלפוחית השתן במכרסם מורדם.

ב Vivo מדידה לומינלית של שחרור ATP אורותלי מעורר התנפחות במכרסמים

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

הפרוטוקול שלנו מודד ATP, משדר חשוב בשלפוחית השתן, שיאפשר לנו להמשיך לחקור את המנגנונים השולטים בשחרורו. הטכניקה שלנו מודדת ATP ישירות מלומן שלפוחית השתן, מה שהופך אותו לרלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר טכניקות המשתמשות בתאים בתרבית או ברקמת שלפוחית השתן. מי שידגימו את ההליך יהיו קיארה הילי וסטפני דוהרטי, טכנאיות מחקר במעבדה שלי.כדי להתחיל, יש להשרות הרדמה ראשונית על ידי הנחת בעל החיים בקופסה סגורה עם 4% עד 5% איזופלורן בחמצן. מתן תת עורי של האורתן דו-צדדי, ולאחר מכן הכנס את בעל החיים לכלוב כדי לאפשר לשופכן להיכנס לתוקף במשך כמעט שעתיים. לאחר ההמתנה לכניסת השופכן לתוקף, יש לבדוק מישור הרדמה תקין על ידי צביטת כף רגלו של בעל החיים באמצעות מלקחיים.כדי למנוע את התכווצות שלפוחית השתן בתגובה להתנפחות במהלך הניסוי, הזריקו לחיה חומר חוסם גנגליוני, הקסמטוניום. לאחר מכן, יש למרוח משחת עיניים על עיני החיה כדי למנוע התייבשות במהלך הניסוי. כעת יש לגלח את בטנו של בעל החיים ולבצע לפרוטומיה בקו האמצע כדי לחשוף את שלפוחית השתן.באמצעות להבה, יש להדליק קצה אחד של צינור PE50 באורך קצר, להכניס מחט באורך 22 לקצה השני של הצינור ולמלא אותו בתמיסת קרבס. מניחים לולאה קטנה של תפר משי 3-0 מעל כיפת שלפוחית השתן ומבצעים ציסטסטומיה קטנה להחדרת הקצה המתלקח של הצנתר. תוך כדי החזקת הצנתר ביד אחת, הדקו את לולאת התפר כדי לאבטח את הצנתר במקומו ביד השנייה.לסיים את אבטחת הצנתר על ידי קשירת שני קשרים בתפר. משוך את הצנתר לאחור עד שהראש המתלקח בא במגע עם דופן שלפוחית השתן. בדוק את ההתקנה עבור דליפות על ידי החדרת כמות קטנה של תמיסת קרבס דרך הצנתר.יש לטבול את קצה הצנתר בעירוי בחומר סיכה כירורגי. החזיקו את בשר השופכה החיצוני בעדינות בעזרת זוג מלקחיים, והכניסו את קצה הצנתר לפתח השופכה לכיוון הזנב, כמתואר בכתב היד. סובבו את הצנתר ב-90 מעלות והתקדמו בעדינות.הכנס את הצנתר עד שרכזת נעילת הפיתוי תהיה דיסטלית של חמישה מילימטרים מפתח השופכה החיצוני. אבטחו את הצנתר ומנעו דליפה סביב הצנתר על ידי לולאת אורך קצר של תפר משי 3-0 סביב בשר השופכה החיצוני וקשירתו בחוזקה. הצמידו את הצנתר לזנב בעזרת נייר דבק כדי למנוע ממנו להישלף בטעות.לאחר הצנתור, יש להחדיר בעדינות תמיסת קרבס לשלפוחית השתן דרך צנתר שלפוחית השתן הסופרפובי, ולאשר שהנוזל זורם החוצה מצנתר השופכה ולא סביבו. סגור את חתך הבטן מעל שלפוחית השתן באמצעות תפר משי 3-0. הניחו כרית תחתונה סופגת על כרית חימום כדי לשמור על חום הגוף ולספוג נוזלים.אבטחו את בעל החיים על הלוח המשופע כדי לסייע בניקוז נוזל תוך שלפוחית דרך צנתר השופכה, ואז הפעילו את כרית החימום. חבר את הצנתר העל-כיווני לזין עצירה תלת-כיווני המחבר את הצנתר למשאבת מזרק ומתמר לחץ. חבר את מתמר הלחץ למחשב באמצעות מגבר ומערכת קליטת נתונים.יש להחדיר תמיסת קרבס דרך הצנתר הסופרפובי בקצב של 0.1 מיליליטר לדקה, ולאפשר לנוזל להתנקז דרך צנתר השופכה למשך שעה כדי לשטוף את שאריות ה-ATP שהשתחררו במהלך השתלות הצנתר. לאחר תקופת שטיפה זו, יש לסגור את צנתר השופכה באמצעות פקק נעילת פתימה. למדוד את הלחץ בשלפוחית השתן ולחפש עלייה איטית בלחץ תוך שלפוחית ללחץ של 30 ס"מ מים ללא עלייה חדה בלחץ, המעידה על התכווצות שלפוחית השתן.הסר את התקע מקטטר השופכה כאשר הלחץ מגיע למים של 30 ס"מ כדי למנוע נזק לשלפוחית השתן. להחדיר את שלפוחית השתן ולאסוף את eluent מן קטטר השופכה. בדוק 100 microliter aliquots של eluent מיד עבור ATP או להקפיא לכימות אצווה מאוחר יותר.כדי לבדוק את ההשפעה של התנפחות שלפוחית השתן על ריכוזי ATP לומינליים, יש לסגור את צנתר השופכה עם התקע ולנטר את לחץ השלפוחית עד שהוא מגיע לרמה הרצויה, ולאחר מכן לפתוח את מכסה צנתר השופכה ולאסוף את הלואנט למדידה או הקפאה של ATP, כמתואר לעיל. לאחר כל התנפחות יש לאפשר לשלפוחית השתן לנוח ולשטוף אותה למשך 10 עד 15 דקות לפני נטילת דגימות נוספות. כדי לבדוק את השפעת התרופות על שחרור ATP, החליפו את תמיסת קרבס המחדירה את שלפוחית השתן לקרבס המכילה את תרופת הבחירה.יש לערבב את התרופה למשך 10 עד 15 דקות כדי להשפיע, ולאחר מכן לאסוף את הדגימות משלפוחית השתן הלא נפוחה והנפוחה, כפי שהודגם קודם לכן. מניחים דגימה של 100 מיקרוליטר של פרפוזט עם 50 מיקרוליטר של תערובת הבדיקה בלומינומטר לקריאה. כדי להמיר מיחידות אור יחסיות לריכוז ATP, בצע דילולים סדרתיים של ATP בתמיסת קרבס החל ממיקרומולר אחד ועד 10 פיקומולרי בדילול פי עשרה כדי ליצור עקומה סטנדרטית, וקרא אותם בלומינומטר.שרטט את הקריאות המתקבלות על גרף ובצע רגרסיה לא ליניארית כדי להסיק ריכוזים מהדגימות שנלקחו מהחיה. עירוי התמיסה לשלפוחית השתן בזמן שקטטר השופכה מחובר גורם ללחץ תוך שלפוחית לעלות בחדות ככל ששלפוחית השתן מתכווצת. לאחר מתן hexamethonium נצפתה עלייה הדרגתית יותר בלחץ תוך שלפוחית, המאפשרת ללחץ לעלות עד 30 ס"מ מים ללא התכווצות.FCF כחול מבריק מקטין באופן משמעותי את שיפוע העקומה הסטנדרטית, מספיק כדי לשנות את הערכים המחושבים עבור ריכוז ATP במדגם. חישוב ריכוז ה-ATP בדגימה באמצעות תקן קרבס המכיל FCF כחול מבריק יכול לגרום להערכת חסר של ריכוז ה-ATP ב-50% התנפחות שלפוחית השתן מעלה את ריכוזי ה-ATP הלומינליים, אשר יכולים להיות מופחתים בנוכחות NTPDase apvrase, או לעלות כאשר מעכבים NTPD ACE אנדוגניים עם ARL67156. שחרור ATP המושרה על ידי מתיחה מן השתן נותח.שחרור ATP מעורר התנפחות נחסם על ידי אנטגוניסטים של תעלת פנקטין, FCF כחול מבריק וקרבונוקסולון, אך לא עם אנטגוניסט ערוץ קונקסון, 18 חומצה אלפא-גליצירטינית. זה הכרחי שכל קריאות הלומינומטר יומרו לריכוזים של ATP באמצעות העקומה הסטנדרטית המתאימה, מכיוון שתגובת לוציפר לוציפראז רגישה מאוד להפרעות על ידי מגוון רחב של סוכנים שונים. הטכניקה שלנו יכולה לשמש לחקר השחרור מעורר התנפחות של כל מולקולה בלומן של שלפוחית השתן, בהנחה שקיימת בדיקה מתאימה למולקולה זו.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

משלוח שחרור איטי תרופות דרך Elvax 40W לרשתית העכברוש: ​​השלכות לטיפול במצבים כרוניים

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

איבר מרוחק איסכמי אכשור קד: טכניקת neuroprotective במכרסמים

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

טלמטריה תוך רחמי למדידת לחץ עכבר התכווצות<em&gt; In vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

הערכת Transcutaneous של תפקוד כלייתי במכרסמי Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

שלבי הכנה מדידה של תגובתיות ב העכבר רבים ברשתית Vivo לשעבר

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

שימוש בביופסיה כימית להערכת איכות השתל

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...