Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) a JMB (DK117884).

Tutte le procedure eseguite nei roditori devono aderire alle linee guida applicabili ed essere approvate dal comitato di revisione etica istituzionale locale. Gli esperimenti eseguiti per questo manoscritto sono stati condotti in conformità con la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della School of Medicine dell'Università di Pittsburgh. Vedere la Figura 1 per una ...

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	<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+urinary+tract+in+health+and+disease.">Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease.</a> Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Autonomic Neuroscience: Basic &amp; Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).</li><li>Silva-Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+may+be+a+dynamic+biomarker+of+detrusor+overactivity+in+women+with+overactive+bladder+syndrome.">Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome.</a> PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).</li><li>Sun, Y., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+extracellular+ATP+signaling+in+bladder+urothelial+cells+from+patients+with+interstitial+cystitis.">Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).</li><li>Gill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+as+an+indicator+of+infection+and+inflammation+of+the+urinary+tract+in+patients+with+lower+urinary+tract+symptoms.">Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms.</a> BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).</li><li>S&#228;ve, S., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+and+P2Y+receptor+activation+induce+a+proinflammatory+host+response+in+the+human+urinary+tract.">Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).</li><li>Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overactive+and+underactive+bladder+dysfunction+is+reflected+by+alterations+in+urothelial+ATP+and+NO+release.">Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release.</a> Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).</li><li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder.">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).</li><li>Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+long-term+culture+of+differentiated+normal+rat+urothelial+cells+in+vitro.">Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).</li><li>Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+instillation+procedure+in+adult+male+mouse.">Transurethral instillation procedure in adult male mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).</li><li>Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+in+a+small+animal+model:+Transurethral+catheterization+of+male+and+female+mice.">Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).</li><li>Uvin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cystometry+in+small+rodents:+a+study+of+bladder+chemosensation.">The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).</li><li>Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+oxidation+of+luciferin+without+luciferase+and+the+mechanism+of+bioluminescence.">Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence.</a> Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

La maggior parte della ricerca sul rilascio di ATP uroteliale è condotta in cellule in coltura, utilizzando linee cellulari immortalizzate o colture primarie di cellule uroteliali di roditori. Mentre questi modelli hanno il vantaggio di essere relativamente alti (cioè, una coltura / passaggio può fare molti piatti / piatti di cellule), la loro rilevanza fisiologica è diminuita a causa di: 1) l'incapacità delle cellule uroteliali di crescere polarizzate a meno che non siano coltivate su supporti speciali e 2) la diff...

Si ritiene che l'ATP urinario svolga un ruolo sensoriale significativo nel controllo della minzione1. Ad esempio, si pensa che l'ATP venga rilasciato dall'urotelio in risposta alla distensione dove può agire sui recettori sui nervi afferenti della vescica per aumentare la loro eccitabilità, portando a sensazioni di pienezza2. Pertanto, si pensa anche che l'ATP urinario potrebbe essere un attore importante nello sviluppo delle patologie della vescica. A sostegno di questa ipotesi, le concentrazioni urinarie di ATP sono significativamente aumentate nei pazienti affetti da vescica iperattiva (OAB)3, sindrome da dolore alla vescica/cistite interstiziale (BPS/IC)4 o infezione del tratto urinario (UTI)5,6, tutte condizioni caratterizzate da maggiore urgenza, frequenza e, talvolta, dolore. Al contrario, i pazienti affetti da vescica iperattiva (UAB), che è caratterizzata da un'incapacità di svuotare la vescica e talvolta può includere una ridotta capacità di percepire la pienezza della vescica, hanno dimostrato di avere una diminuzione delle concentrazioni urinarie di ATP7. Sperimentalmente, la manipolazione delle concentrazioni urinarie di ATP può alterare i riflessi della vescica nel ratto; aumentare le concentrazioni di ATP bloccando le ATPasi endogene nel lume della vescica può aumentare la frequenza di minzione, mentre la diminuzione delle concentrazioni di ATP instillando ATPasi esogene nella vescica riduce la frequenza di minzione8. Pertanto, l'importanza dell'ATP urinario per la funzione della vescica è chiara.
Data l'apparente importanza dell'ATP urinario per la patologia della vescica, la misurazione accurata del rilascio uroteliale di ATP è un passo importante nella comprensione dei meccanismi che controllano il rilascio. Molti studi sono stati completati utilizzando diversi modelli sperimentali per misurare il rilascio uroteliale di ATP. Il primo tra questi sono le colture cellulari, sia colture primarie che linee cellulari. Tuttavia, l'uso di cellule uroteliali in coltura è complicato dal fatto che le cellule uroteliali non assumono la loro fisiologica morfologia polarizzata a meno che non siano cresciute su speciali membrane permeabili (come la tecnologia Transwell [inserti pozzo])9. Pertanto, è difficile correlare qualsiasi rilascio di ATP misurato alla fisiologia. Le cellule uroteliali cresciute su inserti di pozzetti possono polarizzarsi e formare una barriera simile a quella che si vede in vivo; Tuttavia, la crescita di un urotelio completamente differenziato può richiedere giorni o settimane. Inoltre, mentre è possibile montare inserti di pozzetti in una camera di Ussing e applicare pressione sul lato apicale per causare allungamento, è difficile applicare una pressione sufficiente per imitare le condizioni all'interno della vescica durante la patologia (cioè pressioni di 30 cm H2O o superiori). L'intero tessuto vescicale può anche essere montato in una camera di Ussing per esperimenti di allungamento, ma questo rimuove la vescica dall'organismo insieme ai fattori trofici che mantengono la salute delle cellule uroteliali e, quindi, la funzione di barriera uroteliale. Pertanto, il modo fisiologicamente più rilevante per studiare il rilascio di ATP dall'urotelio in risposta allo stiramento o alla pressione è in vivo. Le tecniche chirurgiche necessarie per impostare l'esperimento sono identiche a quelle comunemente utilizzate nella cistometria animale e, pertanto, dovrebbero essere facilmente eseguite da chiunque abbia familiarità con tale tecnica.
In questo protocollo, descriveremo la tecnica utilizzata per esaminare l'ATP luminale in ratti femmina di Sprague Dawley del peso di circa 200-250 g, poiché il cateterismo transuretrale descritto di seguito è molto più facile nelle femmine; Tuttavia, il cateterismo transuretrale può essere eseguito anche nei roditori maschi10. Poiché il cateterismo transuretrale è stato eseguito in topi di entrambi i sessi e11, questi esperimenti possono essere facilmente adattati per topi o ratti di entrambi i sessi o di dimensioni variabili, a seconda delle esigenze del team di ricerca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

Si ritiene che l'ATP, rilasciato dall'urotelio in risposta alla distensione della vescica, svolga un ruolo sensoriale significativo nel controllo della minzione. Pertanto, una misurazione accurata del rilascio uroteliale di ATP in un contesto fisiologico è un primo passo importante nello studio dei meccanismi che controllano la segnalazione purinergica nella vescica urinaria. Le tecniche esistenti per studiare il rilascio uroteliale di ATP evocato meccanicamente utilizzano cellule in coltura placcate su supporti flessibili o tessuto vescicale appuntato nelle camere di Ussing; Tuttavia, ognuna di queste tecniche non emula completamente le condizioni nella vescica intatta. Pertanto, è stata sviluppata una configurazione sperimentale per misurare direttamente le concentrazioni di ATP nel lume della vescica urinaria del roditore.
In questa configurazione, le vesciche dei roditori anestetizzati vengono perfuse attraverso cateteri sia nella cupola della vescica che attraverso l'orifizio uretrale esterno. La pressione nella vescica viene aumentata tappando il catetere uretrale mentre perfonde il fluido sterile nella vescica attraverso la cupola. La misurazione della pressione intravescicale viene ottenuta utilizzando un trasduttore di pressione collegato al catetere a cupola della vescica, simile alla configurazione utilizzata per la cistometria. Una volta raggiunta la pressione desiderata, il cappuccio del catetere uretrale viene rimosso e il fluido raccolto per la quantificazione dell'ATP mediante saggio luciferina-luciferasi. Attraverso questa configurazione sperimentale, i meccanismi che controllano la stimolazione meccanica e chimica del rilascio uroteliale di ATP possono essere interrogati includendo vari agonisti o antagonisti nel perfusato o confrontando i risultati tra animali wildtype e geneticamente modificati.

Il protocollo descritto consente la misurazione accurata del rilascio uroteliale di ATP in vivo dal lume della vescica, utilizzando una versione modificata della configurazione standard della cistometria dei roditori (vedere Figura 1). Ciò consente al ricercatore di esaminare gli effetti dei farmaci sul rilascio di ATP mediato dallo stiramento in un ambiente fisiologico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="...

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In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Questo protocollo descrive la procedura per misurare le concentrazioni di ATP nel lume della vescica in un roditore anestetizzato.

In vivo Misurazione luminale del rilascio uroteliale di ATP evocato dalla distensione nei roditori

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Il nostro protocollo misura l'ATP, un importante trasmettitore nella vescica urinaria, che ci permetterà di interrogare ulteriormente i meccanismi che ne controllano il rilascio. La nostra tecnica misura l'ATP direttamente dal lume della vescica, rendendolo più fisiologicamente rilevante rispetto alle tecniche che utilizzano cellule in coltura o tessuto vescicale A dimostrare la procedura saranno Keara Healy e Stephanie Daugherty, tecnici di ricerca nel mio laboratorio.Per iniziare, indurre l'anestesia iniziale mettendo l'animale in una scatola chiusa gassata con isoflurano dal 4% al 5% in ossigeno. Somministrare per via sottocutanea l'uretano bilateralmente, quindi mettere l'animale in una gabbia per consentire all'uretano di avere effetto per quasi due ore. Dopo aver atteso che l'uretano abbia effetto, testare un piano adeguato di anestesia pizzicando il piede dell'animale usando una pinza.Per prevenire la contrazione della vescica in risposta alla distensione durante l'esperimento, iniettare l'animale con un agente bloccante gangliare, l'esametonio. Quindi, applicare un unguento oftalmico agli occhi dell'animale per prevenire l'essiccazione durante l'esperimento. Ora radere l'addome dell'animale ed eseguire una laparotomia della linea mediana per esporre la vescica urinaria.Usando una fiamma, bruciare un'estremità di un tubo intramedico PE50 di breve lunghezza, posizionare un ago calibro 22 nell'altra estremità del tubo e riempirlo con la soluzione di Krebs. Posizionare un piccolo anello di sutura di seta 3-0 sulla cupola della vescica ed eseguire una piccola cistostomia per inserire l'estremità svasata del catetere. Tenendo il catetere con una mano, stringere l'anello di sutura per fissare il catetere in posizione con l'altra mano.Terminare il fissaggio del catetere legando due nodi nella sutura. Tirare indietro il catetere fino a quando la testa svasata è in contatto con la parete della vescica. Testare la configurazione per le perdite infondendo una piccola quantità di soluzione di Krebs attraverso il catetere.Immergere l'estremità di un catetere IV nel lubrificante chirurgico. Tenere delicatamente il meato uretrale esterno con un paio di pinze e inserire la punta del catetere nell'orifizio uretrale nella direzione della coda, come descritto nel manoscritto. Ruotare il catetere di 90 gradi e avanzare delicatamente.Inserire il catetere fino a quando il mozzo luer lock è distale di cinque millimetri dall'apertura uretrale esterna. Fissare il catetere e prevenire perdite intorno al catetere avvolgendo una breve lunghezza di sutura di seta 3-0 attorno al meato uretrale esterno e legandolo saldamente. Fissare il catetere alla coda con del nastro adesivo per evitare che venga estratto accidentalmente.Una volta cateterizzato, infondere delicatamente la soluzione di Krebs nella vescica attraverso il catetere vescica sovrapubica e confermare che il fluido fuoriesce dal catetere uretrale e non intorno ad esso. Chiudere l'incisione addominale sopra la vescica usando una sutura di seta 3-0. Posizionare un sottopad assorbente su una piastra riscaldante per mantenere il calore corporeo e assorbire il liquido.Fissare l'animale sulla tavola inclinata per aiutare a drenare il liquido intravescicale attraverso il catetere uretrale, quindi accendere la piastra riscaldante. Collegare il catetere sovrapubico a un rubinetto di arresto a tre vie che collega il catetere a una pompa a siringa e un trasduttore di pressione. Collegare il trasduttore di pressione a un computer tramite un amplificatore e un sistema di acquisizione dati.Infondere la soluzione di Krebs attraverso il catetere sovrapubico ad una velocità di 0,1 millilitri al minuto e lasciare che il fluido defluisca attraverso il catetere uretrale per un'ora per lavare qualsiasi ATP residuo rilasciato durante gli impianti del catetere. Dopo questo periodo di washout, tappare il catetere uretrale usando un tappo luer lock. Misurare la pressione nella vescica e cercare un lento aumento della pressione intravescicale a una pressione di 30 centimetri d'acqua senza un forte aumento della pressione, indicando una contrazione della vescica.Rimuovere il tappo dal catetere uretrale quando la pressione raggiunge i 30 centimetri d'acqua per evitare danni alla vescica. Infondere la vescica e raccogliere l'eluente dal catetere uretrale. Testare immediatamente 100 microlitri di aliquote dell'eluente per l'ATP o congelare per la successiva quantificazione del lotto.Per testare l'effetto della distensione della vescica sulle concentrazioni luminali di ATP, tappare il catetere uretrale con il tappo e monitorare la pressione della vescica fino a raggiungere il livello desiderato, quindi aprire il catetere uretrale e raccogliere l'eluente per la misurazione o il congelamento dell'ATP, come descritto sopra. Dopo ogni distensione, lasciare riposare la vescica e lavarsi per 10-15 minuti prima di prelevare ulteriori campioni. Per testare l'effetto dei farmaci sul rilascio di ATP, cambiare la soluzione di Krebs che infonde la vescica a Krebs contenente il farmaco di scelta.Perfondere il farmaco per 10-15 minuti per avere un effetto, quindi raccogliere i campioni da vesciche non distese e distese, come dimostrato in precedenza. Posizionare un campione di 100 microlitri di perfulato con 50 microlitri della miscela di dosaggio nel luminometro per la lettura. Per convertire da unità di luce relativa alla concentrazione di ATP, effettuare diluizioni seriali di ATP in soluzione di Krebs che vanno da un micromolare a 10 picomolar in diluizioni di dieci volte per creare una curva standard e leggerle nel luminometro.Tracciare le letture risultanti su un grafico ed eseguire una regressione non lineare per estrapolare le concentrazioni dai campioni prelevati dall'animale. L'infusione della soluzione nella vescica mentre il catetere uretrale è tappato fa aumentare bruscamente la pressione intravescicale mentre la vescica si contrae. Dopo la somministrazione di esametonio, è stato osservato un aumento più graduale della pressione intravescicale, consentendo alla pressione di salire fino a 30 centimetri di acqua senza contrazione.Il blu brillante FCF diminuisce significativamente la pendenza della curva standard, sufficiente a modificare i valori calcolati per la concentrazione di ATP nel campione. Il calcolo della concentrazione di ATP in un campione utilizzando lo standard di Krebs contenente FCF blu brillante può comportare una sottostima della concentrazione di ATP del 50%La distensione della vescica aumenta le concentrazioni luminali di ATP, che possono essere diminuite in presenza di apvrasi NTPDasi, o aumentate quando gli ACE NTPD endogeni sono inibiti con ARL67156. È stato analizzato il rilascio di ATP indotto dallo stiramento dall'urotelio.Il rilascio di ATP evocato dalla distensione è bloccato dagli antagonisti del canale della panectina, FCF blu brillante e carbonoxolone, ma non con un antagonista del canale della connessione, l'acido 18 alfa-glicirretico. È imperativo che tutte le letture del luminometro siano convertite in concentrazioni di ATP utilizzando la curva standard appropriata, poiché la reazione lucifera luciferasiche è altamente suscettibile alle interferenze di un'ampia varietà di agenti diversi. La nostra tecnica potrebbe essere utilizzata per studiare il rilascio evocato dalla distensione di qualsiasi molecola nel lume della vescica, supponendo che esista un saggio adatto per quella molecola.

Research

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