Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
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이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK)에서 JMB (DK117884)로의 보조금으로 지원되었습니다.

설치류에서 수행되는 모든 절차는 해당 지침을 준수해야하며 지역 기관 윤리 검토위원회의 승인을 받아야합니다. 이 원고를 위해 수행 된 실험은 국립 연구위원회의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 피츠버그 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 표준 설치류 방광 측정 설정의 수정 된 버전은 그림 ...

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

요로 상피 ATP 방출에 대한 대부분의 연구는 불멸화 된 세포주 또는 설치류 요로 상피 세포의 1 차 배양을 사용하여 배양 된 세포에서 수행됩니다. 이러한 모델은 상대적으로 높은 처리량(즉, 하나의 배양/계대가 많은 세포 플레이트/접시를 만들 수 있음)이라는 이점이 있지만, 1) 특수 지지체에서 성장하지 않는 한 요로 상피 세포가 분극적으로 성장할 수 없고 2) 배양된 세포를 생리학적 수준의 스?...

비뇨기 ATP는 배뇨1의 조절에 중요한 감각적 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 예를 들어, ATP는 방광 구 심성 신경의 수용체에 작용하여 흥분성을 증가시켜 충만감을 유발할 수있는 팽창에 반응하여 요로 상피에서 방출되는 것으로 생각됩니다2. 따라서 비뇨기 ATP는 방광 병리의 발달에 중요한 역할을 할 수 있다고 생각됩니다. 이 가설을 뒷받침하기 위해 과민성 방광(OAB)3, 방광 통증 증후군/간질성 방광염(BPS/IC)4 또는 요로 감염(UTI)5,6을 앓고 있는 환자에서 요중 ATP 농도가 유의하게 증가하며, 모든 상태는 긴급성, 빈도 및 때로는 통증 증가를 특징으로 합니다. 반대로, 방광을 비울 수 없고 때때로 방광 충만감을 감지하는 능력이 감소할 수 있는 저활동성 방광(UAB)을 앓고 있는 환자는 소변 ATP 농도가 감소한 것으로나타났습니다7. 실험적으로 소변 ATP 농도를 조작하면 쥐의 방광 반사가 바뀔 수 있습니다. 방광 내강에서 내인성 ATPase를 차단하여 ATP 농도를 높이면 배뇨 빈도가 증가할 수 있는 반면, 외인성 ATPase를 방광에 주입하여 ATP 농도를 낮추면 배뇨 빈도가 감소합니다8. 따라서 방광 기능에 대한 비뇨기 ATP의 중요성은 분명합니다.
방광 병리학에 대한 비뇨기 ATP의 명백한 중요성을 감안할 때, 요로 상피 ATP 방출의 정확한 측정은 방출을 제어하는 메커니즘을 이해하는 데 중요한 단계입니다. 요로 상피 ATP 방출을 측정하기 위해 다양한 실험 모델을 사용하여 많은 연구가 완료되었습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 1 차 배양 또는 세포주 중 하나 인 세포 배양입니다. 그러나 배양된 요로상피 세포의 사용은 요로상피 세포가 특수 투과성 막(예: Transwell 기술[웰 인서트])에서 성장하지 않는 한 생리학적 분극 형태를 취하지 않는다는 사실로 인해 복잡합니다.9. 따라서, 측정된 임의의 ATP 방출을 생리학과 연관시키는 것은 어렵다. 웰 삽입물에서 성장한 요로 상피 세포는 분극화되어 생체 내에서 볼 수있는 것과 유사한 장벽을 형성 할 수 있습니다. 그러나 완전히 분화 된 요로 상피의 성장에는 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 추가적으로, 웰 인서트를 Ussing 챔버에 장착하고 정점 측에 압력을 가하여 스트레칭을 유발할 수 있지만, 병리학 동안 방광 내부의 조건(즉, 30cmH2O이상의 압력)을 모방하기에 충분한 압력을 가하는 것은 어렵다. 전체 방광 조직은 스트레치 실험을 위해 Ussing 챔버에 장착 할 수도 있지만, 이는 요로 상피 세포 건강 및 요로 상피 장벽 기능을 유지하는 영양 인자와 함께 유기체에서 방광을 제거합니다. 따라서 스트레칭이나 압력에 반응하여 요로 상피에서 ATP의 방출을 연구하는 가장 생리 학적으로 관련된 방법은 생체 내입니다. 실험을 설정하는 데 필요한 수술 기술은 동물 방광 측정술에서 일반적으로 사용되는 것과 동일하므로 해당 기술에 익숙한 사람이라면 누구나 쉽게 수행 할 수 있어야합니다.
이 프로토콜에서는 아래에 설명 된 경 요도 카테터 삽입이 암컷에서 훨씬 쉽기 때문에 체중이 약 200-250g 인 암컷 Sprague Dawley 쥐에서 내강 ATP를 검사하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 그러나, 경요도 카테터 삽입은 또한 수컷 설치류10에서 수행될 수 있다. 경요도 카테터 삽입술이 현재 남녀 모두의 마우스에서도 수행되었기 때문에11, 이러한 실험은 연구팀의 필요에 따라 성별 또는 다양한 크기의 마우스 또는 쥐에 쉽게 적응할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

방광 팽창에 반응하여 요로 상피에서 방출되는 ATP는 배뇨 조절에 중요한 감각 역할을하는 것으로 생각됩니다. 따라서 생리학적 환경에서 요로상피 ATP 방출을 정확하게 측정하는 것은 방광에서 청도성 신호 전달을 제어하는 메커니즘을 연구하는 중요한 첫 번째 단계입니다. 기계적으로 유발 된 요로 상피 ATP 방출을 연구하는 기존 기술은 Ussing 챔버에 고정 된 유연한 지지체 또는 방광 조직에 도금 된 배양 세포를 활용합니다. 그러나 이러한 각 기술은 손상되지 않은 방광의 상태를 완전히 모방하지 않습니다. 따라서 설치류 방광의 내강에서 ATP 농도를 직접 측정하기위한 실험 설정이 개발되었습니다.
이 설정에서 마취 된 설치류의 방광은 방광의 돔과 외부 요도 구멍을 통해 카테터를 통해 관류됩니다. 방광의 압력은 요도 카테터를 덮는 동시에 멸균 유체를 돔을 통해 방광으로 관류함으로써 증가합니다. 방광 내 압력 측정은 방광 돔 카테터에 부착 된 압력 변환기를 사용하여 이루어지며, 방광 측정에 사용되는 설정과 유사합니다. 원하는 압력에 도달하면 요도 카테터의 캡을 제거하고 루시페린-루시페라아제 분석에 의해 ATP 정량화를 위해 유체를 수집합니다. 이 실험 설정을 통해 요로 상피 ATP 방출의 기계적 및 화학적 자극을 제어하는 메커니즘은 관류에 다양한 작용제 또는 길항제를 포함하거나 야생형과 유전자 변형 동물 간의 결과를 비교하여 조사 할 수 있습니다.

설명 된 프로토콜은 표준 설치류 방광 측정 설정의 수정 된 버전을 사용하여 방광 내강에서 생체 내에서 urothelial ATP 방출을 정확하게 측정 할 수 있습니다 ( 그림 1 참조). 이를 통해 연구원은 생리학적 환경에서 스트레치 매개 ATP 방출에 대한 약물의 효과를 조사할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/f...

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In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

이 프로토콜은 마취 된 설치류에서 방광 내강의 ATP 농도를 측정하는 절차를 설명합니다.

생체 내 설치류에서 팽창 유발 요로 상피 ATP 방출의 내강 측정

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

우리의 프로토콜은 방광의 중요한 전달 물질 인 ATP를 측정하여 방출을 제어하는 메커니즘을 추가로 조사 할 수 있습니다. 우리의 기술은 방광 내강에서 직접 ATP를 측정하므로 배양 된 세포 또는 방광 조직을 사용하는 기술보다 생리 학적으로 더 관련이 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Keara Healy와 Stephanie Daugherty가 될 것입니다.시작하려면 산소에서 4%에서 5%이소플루란으로 가스가 공급된 밀폐된 상자에 동물을 넣어 초기 마취를 유도하십시오. 우레탄을 양측으로 피하 투여 한 다음 동물을 케이지에 넣어 우레탄이 거의 2 시간 동안 효과를 발휘할 수 있도록합니다. 우레탄이 효과를 발휘할 때까지 기다린 후 집게를 사용하여 동물의 발을 꼬집어 적절한 마취면을 테스트하십시오.실험 중 팽창에 대한 반응으로 방광의 수축을 방지하려면 동물에게 신경절 차단제 인 헥사 메토 늄을 주사하십시오. 다음으로, 실험 중 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 용 연고를 바르십시오. 이제 동물의 복부를 면도하고 정중선 개복술을 시행하여 방광을 노출시킵니다.화염을 사용하여 짧은 길이의 PE50 의료 튜브의 한쪽 끝을 플레어하고 22게이지 바늘을 튜브의 다른 쪽 끝에 놓고 Krebs 용액으로 채 웁니다. 방광의 돔 위에 3-0 실크 봉합사의 작은 고리를 놓고 작은 방광 절제술을 수행하여 카테터의 플레어 끝을 삽입합니다. 한 손으로 카테터를 잡고 다른 손으로 카테터를 제자리에 고정하기 위해 봉합사 루프를 조입니다.봉합사에 두 개의 매듭을 묶어 카테터 고정을 마칩니다. 플레어 헤드가 방광 벽에 닿을 때까지 카테터를 뒤로 당깁니다. 카테터를 통해 소량의 Krebs 용액을 주입하여 누출 설정을 테스트합니다.IV 카테터의 끝을 수술용 윤활유에 담그십시오. 한 쌍의 집게로 외부 요도 미투스를 부드럽게 잡고 원고에 설명 된대로 카테터 끝을 꼬리 방향으로 요도 구멍에 삽입하십시오. 카테터를 90도 회전하고 부드럽게 전진합니다.루어 잠금 허브가 외부 요도 개구부에서 5mm 떨어져 있을 때까지 카테터를 삽입합니다. 카테터를 고정하고 외부 요도 미투스 주위에 짧은 길이의 3-0 실크 봉합사를 고리로 묶어 카테터 주변의 누출을 방지합니다. 카테터가 실수로 빠지지 않도록 테이프로 꼬리에 고정하십시오.카테터 삽입이 완료되면 치골 상 방광 카테터를 통해 Krebs 용액을 방광에 부드럽게 주입하고 유체가 요도 카테터 주변이 아닌 요도 카테터에서 흘러 나오는지 확인합니다. 3-0 실크 봉합사를 사용하여 방광 위의 복부 절개를 닫습니다. 체온을 유지하고 체액을 흡수하기 위해 가열 패드에 흡수성 언더패드를 놓습니다.요도 카테터를 통해 방광 내 액체를 배출하는 데 도움이 되도록 경사판에 동물을 고정한 다음 가열 패드를 켭니다. 치골 상부 카테터를 카테터를 주사기 펌프 및 압력 변환기에 연결하는 3방향 스톱 콕에 연결합니다. 압력 변환기를 증폭기와 데이터 수집 시스템을 통해 컴퓨터에 연결합니다.분당 0.1 밀리리터의 속도로 치골 상 카테터를 통해 Krebs 용액을 주입하고 유체가 요도 카테터를 통해 1 시간 동안 배출되도록하여 카테터 이식 중에 방출 된 잔류 ATP를 씻어냅니다. 이 세척 기간이 지나면 루어 잠금 플러그를 사용하여 요도 카테터를 덮으십시오. 방광의 압력을 측정하고 방광 수축을 나타내는 급격한 압력 증가없이 방광 내 압력이 30cm 물의 압력으로 천천히 상승하는지 확인하십시오.방광 손상을 방지하기 위해 압력이 30cm 물에 도달하면 요도 카테터에서 플러그를 제거하십시오. 방광을 주입하고 요도 카테터에서 용리액을 수집합니다. ATP에 대해 용리액의 100마이크로리터 분취량을 즉시 테스트하거나 나중에 배치 정량화를 위해 동결합니다.방광 팽창이 내강 ATP 농도에 미치는 영향을 테스트하려면 플러그로 요도 카테터를 덮고 원하는 수준에 도달할 때까지 방광 압력을 모니터링한 다음 요도 카테터의 뚜껑을 열고 위에서 설명한 대로 ATP 측정 또는 동결을 위한 용리액을 수집합니다. 각 팽창 후 방광을 쉬게하고 추가 샘플을 채취하기 전에 10-15 분 동안 씻어냅니다. ATP 방출에 대한 약물의 효과를 테스트하려면 방광을 주입하는 Krebs 용액을 선택한 약물이 들어있는 Krebs로 전환하십시오.효과를 내기 위해 약물을 10-15 분 동안 관류 한 다음 앞에서 설명한 것처럼 팽창되지 않고 팽창 된 방광에서 샘플을 수집하십시오. 100 마이크로리터의 향수물 샘플과 50 마이크로리터의 분석 혼합물을 판독을 위해 루미노미터에 놓습니다. 상대 광 단위에서 ATP 농도로 변환하려면 10 배 희석으로 1 마이크로 몰에서 10 피코 몰 범위의 Krebs 용액에서 ATP의 연속 희석을 만들어 표준 곡선을 만들고 광도계에서 읽습니다.결과 판독값을 그래프에 플로팅하고 비선형 회귀를 수행하여 동물에서 채취한 샘플의 농도를 외삽합니다. 요도 카테터가 막혀있는 동안 방광에 용액을 주입하면 방광이 수축함에 따라 방광 내 압력이 급격히 상승합니다. 헥사 메 토늄 투여 후, 방광 내 압력의보다 점진적인 상승이 관찰되어 수축없이 압력이 30 센티미터까지 상승 할 수있었습니다.브릴리언트 블루 FCF는 표준 곡선의 기울기를 크게 감소시켜 샘플의 ATP 농도에 대해 계산 된 값을 변경하기에 충분합니다. 화려한 청색 FCF를 포함하는 Krebs 표준을 사용하여 샘플에서 ATP 농도를 계산하면 ATP 농도가 50 % 과소 평가 될 수 있습니다 방광의 팽창은 NTPDase apvrase의 존재 하에서 감소 될 수있는 내강 ATP 농도를 증가 시키거나 내인성 NTPD ACE가 ARL67156으로 억제 될 때 증가 할 수 있습니다. 요로상피로부터 스트레치-유도된 ATP 방출을 분석하였다.팽창 유발 ATP 방출은 파넥틴 채널 길항제, 브릴리언트 블루 FCF 및 카르보녹솔론에 의해 차단되지만 코넥슨 채널 길항제인 18알파-글리시레틴산으로는 차단되지 않습니다. 루시퍼 루시페라아제 반응은 다양한 약제의 간섭에 매우 취약하기 때문에 모든 광도계 판독값을 적절한 표준 곡선을 사용하여 ATP 농도로 변환하는 것이 필수적입니다. 우리의 기술은 방광 내강에있는 모든 분자의 팽창 유발 방출을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 해당 분자에 대한 적절한 분석이 존재한다고 가정합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

의식 설치류에서 신장 기능의 경피 평가

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

이식 품질 평가를 위해 화학 생검 사용

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...