Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK) para JMB (DK117884).

Todos os procedimentos realizados em roedores devem seguir as diretrizes aplicáveis e ser aprovados pelo comitê de revisão de ética institucional local. Os experimentos realizados para este manuscrito foram realizados de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina da Universidade de Pittsburgh. Consulte a Figura 1 para obter uma versão ...

<ol>
	<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+urinary+tract+in+health+and+disease.">Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease.</a> Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Autonomic Neuroscience: Basic &amp; Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).</li><li>Silva-Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+may+be+a+dynamic+biomarker+of+detrusor+overactivity+in+women+with+overactive+bladder+syndrome.">Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome.</a> PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).</li><li>Sun, Y., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+extracellular+ATP+signaling+in+bladder+urothelial+cells+from+patients+with+interstitial+cystitis.">Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).</li><li>Gill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+as+an+indicator+of+infection+and+inflammation+of+the+urinary+tract+in+patients+with+lower+urinary+tract+symptoms.">Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms.</a> BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).</li><li>S&#228;ve, S., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+and+P2Y+receptor+activation+induce+a+proinflammatory+host+response+in+the+human+urinary+tract.">Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).</li><li>Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overactive+and+underactive+bladder+dysfunction+is+reflected+by+alterations+in+urothelial+ATP+and+NO+release.">Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release.</a> Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).</li><li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder.">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).</li><li>Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+long-term+culture+of+differentiated+normal+rat+urothelial+cells+in+vitro.">Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).</li><li>Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+instillation+procedure+in+adult+male+mouse.">Transurethral instillation procedure in adult male mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).</li><li>Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+in+a+small+animal+model:+Transurethral+catheterization+of+male+and+female+mice.">Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).</li><li>Uvin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cystometry+in+small+rodents:+a+study+of+bladder+chemosensation.">The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).</li><li>Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+oxidation+of+luciferin+without+luciferase+and+the+mechanism+of+bioluminescence.">Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence.</a> Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

A maioria das pesquisas sobre a liberação de ATP urotelial é conduzida em células cultivadas, usando linhagens celulares imortalizadas ou culturas primárias de células uroteliais de roedores. Embora esses modelos tenham o benefício de ter um rendimento relativamente alto (ou seja, uma cultura/passagem pode produzir muitas placas/pratos de células), sua relevância fisiológica é diminuída devido: 1) à incapacidade das células uroteliais de crescer polarizadas a menos que sejam cultivadas em suportes especiais...

Acredita-se que o ATP urinário desempenhe um papel sensorial significativo no controle da micção1. Por exemplo, pensa-se que o ATP é liberado do urotélio em resposta à distensão, onde pode atuar sobre os receptores nos nervos aferentes da bexiga para aumentar sua excitabilidade, levando a sensações de plenitude2. Assim, pensa-se também que o ATP urinário poderia ser um ator importante no desenvolvimento de patologias da bexiga. Em apoio a essa hipótese, as concentrações urinárias de ATP estão significativamente aumentadas em pacientes que sofrem de bexiga hiperativa (OAB)3, síndrome da dor vesical/cistite intersticial (BPS/IC)4 ou infecção do trato urinário (ITU)5,6, todas as condições caracterizadas pelo aumento da urgência, frequência e, às vezes, dor. Por outro lado, pacientes que sofrem de bexiga hipoativa (BAU), que é caracterizada por uma incapacidade de esvaziar a bexiga e às vezes pode incluir uma diminuição da capacidade de sentir a plenitude da bexiga, demonstraram ter diminuído as concentrações urinárias de ATP7. Experimentalmente, a manipulação das concentrações urinárias de ATP pode alterar os reflexos da bexiga no rato; o aumento das concentrações de ATP pelo bloqueio de ATPases endógenas no lúmen vesical pode aumentar a frequência miccional, enquanto a diminuição das concentrações de ATP pela instilação de ATPases exógenas na bexiga reduz a frequência de micção8. Assim, a importância do ATP urinário para a função da bexiga é clara.
Dada a aparente importância do ATP urinário para a patologia da bexiga, a medição precisa da liberação de ATP urotelial é um passo importante na compreensão dos mecanismos que controlam a liberação. Muitos estudos foram concluídos usando diferentes modelos experimentais para medir a liberação de ATP urotelial. A principal delas são as culturas celulares, sejam culturas primárias ou linhagens celulares. No entanto, o uso de células uroteliais cultivadas é complicado pelo fato de que as células uroteliais não assumem sua morfologia polarizada fisiológica, a menos que sejam cultivadas em membranas permeáveis especiais (como a tecnologia Transwell [inserções de poço])9. Assim, é difícil relacionar qualquer liberação de ATP medida com a fisiologia. As células uroteliais cultivadas em inserções de poços podem polarizar e formar uma barreira semelhante ao que é visto in vivo; no entanto, o crescimento de um urotélio totalmente diferenciado pode levar dias ou semanas. Além disso, embora seja possível montar inserções de poço em uma câmara de Ussing e aplicar pressão no lado apical para causar estiramento, é difícil aplicar pressão suficiente para imitar condições dentro da bexiga durante a patologia (ou seja, pressões de 30 cm H2O ou acima). O tecido da bexiga inteira também pode ser montado em uma câmara de Ussing para experimentos de alongamento, mas isso remove a bexiga do organismo, juntamente com os fatores tróficos que mantêm a saúde das células uroteliais e, portanto, a função de barreira urotelial. Portanto, a maneira fisiologicamente mais relevante de estudar a liberação de ATP do urotélio em resposta ao estiramento ou pressão é in vivo. As técnicas cirúrgicas necessárias para a montagem do experimento são idênticas às comumente utilizadas na cistometria animal e, portanto, devem ser facilmente realizadas por qualquer pessoa familiarizada com essa técnica.
Neste protocolo, descreveremos a técnica utilizada para examinar o ATP luminal em ratas Sprague Dawley com peso aproximado de 200-250 g, pois o cateterismo transuretral descrito a seguir é muito mais fácil em fêmeas; no entanto, o cateterismo transuretral também pode ser realizado em roedores machos10. Como o cateterismo transuretral já foi realizado em camundongos de ambos os sexos também11, esses experimentos podem ser facilmente adaptados para camundongos ou ratos de ambos os sexos ou de tamanhos variados, dependendo das necessidades da equipe de pesquisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

Acredita-se que o ATP, liberado do urotélio em resposta à distensão da bexiga, desempenhe um papel sensorial significativo no controle da micção. Portanto, a medição precisa da liberação de ATP urotelial em um ambiente fisiológico é um primeiro passo importante no estudo dos mecanismos que controlam a sinalização purinérgica na bexiga urinária. As técnicas existentes para estudar a liberação de ATP urotelial evocado mecanicamente utilizam células cultivadas banhadas em suportes flexíveis ou tecido vesical fixado em câmaras de Ussing; no entanto, cada uma dessas técnicas não emula totalmente as condições na bexiga intacta. Portanto, uma configuração experimental foi desenvolvida para medir diretamente as concentrações de ATP no lúmen da bexiga urinária de roedores.
Nesta configuração, as bexigas de roedores anestesiados são perfundidas através de cateteres tanto na cúpula da bexiga quanto através do orifício uretral externo. A pressão na bexiga é aumentada tampando o cateter uretral enquanto perfunde fluido estéril na bexiga através da cúpula. A medição da pressão intravesical é obtida usando um transdutor de pressão ligado ao cateter da cúpula da bexiga, semelhante à configuração usada para cistometria. Uma vez atingida a pressão desejada, a tampa do cateter uretral é removida e o líquido coletado para quantificação de ATP pelo ensaio de luciferina-luciferase. Através desta configuração experimental, os mecanismos que controlam a estimulação mecânica e química da liberação de ATP urotelial podem ser interrogados pela inclusão de vários agonistas ou antagonistas no perfusato ou comparando os resultados entre animais selvagens e geneticamente modificados.

O protocolo descrito permite a medição precisa da liberação de ATP urotelial in vivo do lúmen da bexiga, usando uma versão modificada da configuração padrão de cistometria de roedores (ver Figura 1). Isso permite que o pesquisador examine os efeitos das drogas na liberação de ATP mediada por estiramento em um ambiente fisiológico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64227/64227f...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Este protocolo descreve o procedimento para medir as concentrações de ATP no lúmen da bexiga em um roedor anestesiado.

In vivo Medição Luminal da Liberação de ATP Urotelial Evocado por Distensão em Roedores

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Nosso protocolo mede o ATP, um importante transmissor na bexiga urinária, o que nos permitirá interrogar ainda mais os mecanismos que controlam sua liberação. Nossa técnica mede o ATP diretamente do lúmen da bexiga, tornando-o mais fisiologicamente relevante do que as técnicas que usam células cultivadas ou tecido vesical. Demonstrando o procedimento estarão Keara Healy e Stephanie Daugherty, técnicas de pesquisa no meu laboratório.Para começar, induzir a anestesia inicial colocando o animal em uma caixa fechada gaseificada com isoflurano de 4% a 5% em oxigênio. Por via subcutânea, administre uretano bilateralmente e, em seguida, coloque o animal em uma gaiola para permitir que o uretano faça efeito por quase duas horas. Depois de esperar que o uretano faça efeito, teste um plano adequado de anestesia apertando o pé do animal usando fórceps.Para evitar a contração da bexiga em resposta à distensão durante o experimento, injete no animal um agente bloqueador ganglionar, o hexametônio. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secagem durante o experimento. Agora raspe o abdômen do animal e realize uma laparotomia na linha média para expor a bexiga urinária.Usando uma chama, acender uma extremidade de um comprimento curto de tubo intramédico PE50, colocar uma agulha de calibre 22 na outra extremidade da tubulação e enchê-la com solução de Krebs. Coloque uma pequena alça de sutura de seda 3-0 sobre a cúpula da bexiga e realize uma pequena cistostomia para inserir a extremidade inflamada do cateter. Ao segurar o cateter com uma mão, aperte a alça de sutura para prender o cateter no lugar com a outra mão.Termine de prender o cateter amarrando dois nós na sutura. Puxe o cateter para trás até que a cabeça inflamada esteja em contato com a parede da bexiga. Teste a configuração para vazamentos infundindo uma pequena quantidade de solução de Krebs através do cateter.Mergulhe a extremidade de um cateter IV em lubrificante cirúrgico. Segure o meato uretral externo suavemente com um par de pinças e insira a ponta do cateter no orifício uretral na direção da cauda, conforme descrito no manuscrito. Gire o cateter 90 graus e avance suavemente.Insira o cateter até que o cubo de luer lock esteja a cinco milímetros da abertura uretral externa. Prenda o cateter e evite o vazamento ao redor do cateter enrolando um curto comprimento de sutura de seda 3-0 ao redor do meato uretral externo e amarrando-o com força. Prenda o cateter à cauda com fita adesiva para evitar que ele seja acidentalmente retirado.Uma vez cateterizado, infundir suavemente a solução de Krebs na bexiga através do cateter da bexiga suprapúbica e confirmar que o fluido flui para fora do cateter uretral e não em torno dele. Feche a incisão abdominal sobre a bexiga usando uma sutura de seda 3-0. Coloque uma parte inferior absorvente em uma almofada de aquecimento para manter o calor do corpo e absorver o fluido.Prenda o animal na placa inclinada para ajudar na drenagem do fluido intravesical através do cateter uretral e, em seguida, ligue a almofada de aquecimento. Conecte o cateter suprapúbico a uma torneira de parada de três vias conectando o cateter a uma bomba de seringa e a um transdutor de pressão. Conecte o transdutor de pressão a um computador através de um amplificador e um sistema de aquisição de dados.Infundir a solução de Krebs através do cateter suprapúbico a uma taxa de 0,1 mililitros por minuto e permitir que o fluido escorra através do cateter uretral por uma hora para lavar qualquer ATP residual liberado durante as implantações do cateter. Após este período de lavagem, tampe o cateter uretral usando um plugue luer lock. Meça a pressão na bexiga e procure um aumento lento da pressão intravesical para uma pressão de 30 centímetros de água sem um aumento acentuado da pressão, indicando uma contração da bexiga.Remova o plugue do cateter uretral quando a pressão atingir 30 centímetros de água para evitar danos à bexiga. Infundir a bexiga e coletar o eluente do cateter uretral. Testar alíquotas de 100 microlitros do eluente imediatamente para ATP ou congelar para quantificação posterior do lote.Para testar o efeito da distensão da bexiga nas concentrações luminais de ATP, tampe o cateter uretral com o plugue e monitore a pressão da bexiga até atingir o nível desejado, em seguida, destampe o cateter uretral e colete o eluente para medição ou congelamento de ATP, conforme descrito acima. Após cada distensão, deixe a bexiga descansar e lavar por 10 a 15 minutos antes de coletar amostras adicionais. Para testar o efeito das drogas na liberação de ATP, mude a solução de Krebs que infunde a bexiga para Krebs contendo a droga de escolha.Perfundir a droga por 10 a 15 minutos para ter um efeito e, em seguida, coletar as amostras de bexigas não distendidas e distendidas, como demonstrado anteriormente. Coloque 100 microlitros de amostra de perfusato com 50 microlitros da mistura de ensaio no luminômetro para leitura. Para converter de unidades de luz relativas para a concentração de ATP, faça diluições seriais de ATP em solução de Krebs variando de um micromolar a 10 picomolares em diluições de dez vezes para criar uma curva padrão e leia-as no luminômetro.Plotar as leituras resultantes em um gráfico e realizar uma regressão não linear para extrapolar as concentrações das amostras retiradas do animal. A infusão da solução na bexiga enquanto o cateter uretral está entupido faz com que a pressão intravesical aumente acentuadamente à medida que a bexiga se contrai. Após a administração de hexametônio, observou-se um aumento mais gradual da pressão intravesical, permitindo que a pressão subisse até 30 centímetros de água sem contração.O FCF azul brilhante diminui significativamente a inclinação da curva padrão, suficiente para alterar os valores calculados para a concentração de ATP na amostra. O cálculo da concentração de ATP em uma amostra usando o padrão de Krebs contendo FCF azul brilhante pode resultar em uma subestimação da concentração de ATP em 50%A distensão da bexiga aumenta as concentrações luminais de ATP, que podem ser diminuídas na presença de NTPDase apvrase ou aumentadas quando as ECA NTPD endógenas são inibidas com ARL67156. A liberação de ATP induzida por estiramento do urotélio foi analisada.A liberação de ATP evocada por distensão é bloqueada pelos antagonistas do canal de panectina, FCF azul brilhante e carbonoxolona, mas não com um antagonista do canal de conexônio, ácido alfa-glicirretínico 18. É imperativo que todas as leituras do luminômetro sejam convertidas em concentrações de ATP usando a curva padrão apropriada, pois a reação da Lucifer Luciferase é altamente suscetível à interferência de uma ampla variedade de agentes diferentes. Nossa técnica poderia ser usada para estudar a liberação evocada por distensão de qualquer molécula no lúmen da bexiga, assumindo que existe um ensaio adequado para essa molécula.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Medicina

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

De liberação lenta Drug Delivery através Elvax 40W para o Rat Retina: implicações para o tratamento de condições crônicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Membro Remoto Pré-Condicionamento Isquêmico: A Técnica neuroprotetor em roedores

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Avaliação transcutânea da função renal em roedores conscientes

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Usando uma biópsia química para avaliação da qualidade do enxerto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...