Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) a JMB (DK117884).

Todos los procedimientos llevados a cabo en roedores deben cumplir con las pautas aplicables y ser aprobados por el comité local de revisión de ética institucional. Los experimentos realizados para este manuscrito se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh. Consulte la Figura ...

<ol>
	<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+urinary+tract+in+health+and+disease.">Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease.</a> Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Autonomic Neuroscience: Basic &amp; Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).</li><li>Silva-Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+may+be+a+dynamic+biomarker+of+detrusor+overactivity+in+women+with+overactive+bladder+syndrome.">Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome.</a> PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).</li><li>Sun, Y., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+extracellular+ATP+signaling+in+bladder+urothelial+cells+from+patients+with+interstitial+cystitis.">Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).</li><li>Gill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+as+an+indicator+of+infection+and+inflammation+of+the+urinary+tract+in+patients+with+lower+urinary+tract+symptoms.">Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms.</a> BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).</li><li>S&#228;ve, S., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+and+P2Y+receptor+activation+induce+a+proinflammatory+host+response+in+the+human+urinary+tract.">Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).</li><li>Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overactive+and+underactive+bladder+dysfunction+is+reflected+by+alterations+in+urothelial+ATP+and+NO+release.">Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release.</a> Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).</li><li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder.">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).</li><li>Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+long-term+culture+of+differentiated+normal+rat+urothelial+cells+in+vitro.">Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).</li><li>Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+instillation+procedure+in+adult+male+mouse.">Transurethral instillation procedure in adult male mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).</li><li>Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+in+a+small+animal+model:+Transurethral+catheterization+of+male+and+female+mice.">Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).</li><li>Uvin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cystometry+in+small+rodents:+a+study+of+bladder+chemosensation.">The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).</li><li>Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+oxidation+of+luciferin+without+luciferase+and+the+mechanism+of+bioluminescence.">Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence.</a> Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

La mayor parte de la investigación sobre la liberación urotelial de ATP se lleva a cabo en células cultivadas, utilizando líneas celulares inmortalizadas o cultivos primarios de células uroteliales de roedores. Si bien estos modelos tienen la ventaja de tener un rendimiento relativamente alto (es decir, un cultivo / pasaje puede hacer muchas placas / platos de células), su relevancia fisiológica disminuye debido a: 1) la incapacidad de las células uroteliales para crecer polarizadas a menos que se cultiven en sop...

Se cree que el ATP urinario desempeña un papel sensorial significativo en el control de la micción1. Por ejemplo, se cree que el ATP se libera del urotelio en respuesta a la distensión donde puede actuar sobre los receptores sobre los nervios aferentes de la vejiga para aumentar su excitabilidad, dando lugar a sensaciones de plenitud2. Por lo tanto, también se piensa que el ATP urinario podría ser un jugador importante en el desarrollo de patologías de la vejiga. En apoyo de esta hipótesis, las concentraciones urinarias de ATP están significativamente aumentadas en pacientes con vejiga hiperactiva (VH)3, síndrome de dolor vesical/cistitis intersticial (BPS/IC)4 o infección urinaria (ITU)5,6, todas ellas condiciones caracterizadas por mayor urgencia, frecuencia y, a veces, dolor. Por el contrario, se ha demostrado que los pacientes que sufren de vejiga hipoactiva (BAU), que se caracteriza por una incapacidad para vaciar la vejiga y a veces puede incluir una disminución de la capacidad para detectar la plenitud de la vejiga, tienen concentraciones urinarias de ATP disminuidas7. Experimentalmente, la manipulación de las concentraciones urinarias de ATP puede alterar los reflejos vesicales en la rata; El aumento de las concentraciones de ATP mediante el bloqueo de las ATPasas endógenas en la luz de la vejiga puede aumentar la frecuencia miccional, mientras que la disminución de las concentraciones de ATP mediante la instilación de ATPasas exógenas en la vejiga reduce la frecuencia miccional8. Por lo tanto, la importancia del ATP urinario para la función de la vejiga es clara.
Dada la aparente importancia del ATP urinario para la patología de la vejiga, la medición precisa de la liberación urotelial de ATP es un paso importante para comprender los mecanismos que controlan la liberación. Se han completado muchos estudios utilizando diferentes modelos experimentales para medir la liberación urotelial de ATP. Los más importantes son los cultivos celulares, ya sean cultivos primarios o líneas celulares. Sin embargo, el uso de células uroteliales cultivadas se complica por el hecho de que las células uroteliales no adquieren su morfología fisiológica polarizada a menos que se cultiven en membranas permeables especiales (como la tecnología Transwell [insertos de pozo])9. Por lo tanto, es difícil relacionar cualquier liberación de ATP medida con la fisiología. Las células uroteliales cultivadas en insertos de pozos pueden polarizarse y formar una barrera similar a lo que se ve in vivo; Sin embargo, el crecimiento de un urotelio completamente diferenciado puede tardar días o semanas. Además, si bien es posible montar inserciones de pozo en una cámara de Ussing y aplicar presión al lado apical para causar estiramiento, es difícil aplicar suficiente presión para imitar las condiciones dentro de la vejiga durante la patología (es decir, presiones de 30 cm H2O o más). El tejido de toda la vejiga también se puede montar en una cámara de Ussing para experimentos de estiramiento, pero esto elimina la vejiga del organismo junto con los factores tróficos que mantienen la salud de las células uroteliales y, por lo tanto, la función de barrera urotelial. Por lo tanto, la forma fisiológicamente más relevante de estudiar la liberación de ATP del urotelio en respuesta al estiramiento o la presión es in vivo. Las técnicas quirúrgicas necesarias para establecer el experimento son idénticas a las comúnmente utilizadas en la cistometría animal y, por lo tanto, deben ser realizadas fácilmente por cualquier persona familiarizada con esa técnica.
En este protocolo, describiremos la técnica utilizada para examinar el ATP luminal en ratas hembras Sprague Dawley que pesan aproximadamente 200-250 g, ya que el cateterismo transuretral descrito a continuación es mucho más fácil en hembras; Sin embargo, el cateterismo transuretral también puede ser realizado en roedores machos10. Como el cateterismo transuretral también se ha realizado en ratones de ambos sexos11, estos experimentos pueden adaptarse fácilmente para ratones o ratas de cualquier sexo o de diferentes tamaños, dependiendo de las necesidades del equipo de investigación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

Se cree que el ATP, liberado del urotelio en respuesta a la distensión de la vejiga, desempeña un papel sensorial significativo en el control de la micción. Por lo tanto, la medición precisa de la liberación urotelial de ATP en un entorno fisiológico es un primer paso importante en el estudio de los mecanismos que controlan la señalización purinérgica en la vejiga urinaria. Las técnicas existentes para estudiar la liberación urotelial de ATP evocada mecánicamente utilizan células cultivadas en soportes flexibles o tejido vesical fijado en cámaras de Ussing; Sin embargo, cada una de estas técnicas no emula completamente las condiciones en la vejiga intacta. Por lo tanto, se desarrolló una configuración experimental para medir directamente las concentraciones de ATP en la luz de la vejiga urinaria de roedor.
En esta configuración, las vejigas de los roedores anestesiados se perfunden a través de catéteres tanto en la cúpula de la vejiga como a través del orificio uretral externo. La presión en la vejiga aumenta al tapar el catéter uretral mientras se perfunde líquido estéril en la vejiga a través de la cúpula. La medición de la presión intravesical se logra utilizando un transductor de presión conectado al catéter domo de la vejiga, similar a la configuración utilizada para la cistometría. Una vez que se alcanza la presión deseada, se retira la tapa del catéter uretral y se recoge líquido para la cuantificación de ATP mediante el ensayo de luciferina-luciferasa. A través de esta configuración experimental, los mecanismos que controlan la estimulación mecánica y química de la liberación urotelial de ATP pueden ser interrogados mediante la inclusión de varios agonistas o antagonistas en el perfusiónto o mediante la comparación de los resultados entre animales salvajes y genéticamente modificados.

El protocolo descrito permite la medición precisa de la liberación urotelial de ATP in vivo desde el lumen de la vejiga, utilizando una versión modificada de la configuración estándar de cistometría de roedores (ver Figura 1). Esto permite al investigador examinar los efectos de los fármacos en la liberación de ATP mediada por estiramiento en un entorno fisiológico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" sr...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Este protocolo describe el procedimiento para medir las concentraciones de ATP en la luz de la vejiga en un roedor anestesiado.

In vivo Medición luminal de la liberación urotelial de ATP evocada por distensión en roedores

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Nuestro protocolo mide el ATP, un transmisor importante en la vejiga urinaria, lo que nos permitirá interrogar más a fondo los mecanismos que controlan su liberación. Nuestra técnica mide el ATP directamente desde la luz de la vejiga, por lo que es más relevante fisiológicamente que las técnicas que utilizan células cultivadas o tejido vesical. Demostrando el procedimiento estarán Keara Healy y Stephanie Daugherty, técnicas de investigación en mi laboratorio.Para comenzar, inducir la anestesia inicial colocando al animal en una caja cerrada gaseada con 4% a 5% de isoflurano en oxígeno. Administre uretano por vía subcutánea bilateralmente, luego coloque al animal en una jaula para permitir que el uretano haga efecto durante casi dos horas. Después de esperar a que el uretano haga efecto, pruebe un plano adecuado de anestesia pellizcando el pie del animal con fórceps.Para evitar la contracción de la vejiga en respuesta a la distensión durante el experimento, inyecte al animal un agente bloqueador ganglionar, hexametonio. A continuación, aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal para evitar que se seque durante el experimento. Ahora afeite el abdomen del animal y realice una laparotomía de línea media para exponer la vejiga urinaria.Con una llama, encienda un extremo de un tubo intramédico PE50 de corta longitud, coloque una aguja de calibre 22 en el otro extremo del tubo y llénelo con solución de Krebs. Coloque un pequeño bucle de sutura de seda 3-0 sobre la cúpula de la vejiga y realice una pequeña cistostomía para insertar el extremo acampanado del catéter. Mientras sostiene el catéter con una mano, apriete el asa de sutura para asegurar el catéter en su lugar con la otra mano.Termine de asegurar el catéter atando dos nudos en la sutura. Tire del catéter hacia atrás hasta que la cabeza ensanchada esté en contacto con la pared de la vejiga. Pruebe la configuración para detectar fugas infundiendo una pequeña cantidad de solución de Krebs a través del catéter.Sumerja el extremo de un catéter intravenoso en lubricante quirúrgico. Sostenga suavemente el meato uretral externo con un par de fórceps e inserte la punta del catéter en el orificio uretral en la dirección de la cola, como se describe en el manuscrito. Gire el catéter 90 grados y avance suavemente.Inserte el catéter hasta que el cubo de bloqueo luer esté cinco milímetros distal de la abertura uretral externa. Asegure el catéter y evite fugas alrededor del catéter enrollando una longitud corta de sutura de seda 3-0 alrededor del meato uretral externo y atándolo firmemente. Asegure el catéter a la cola con cinta adhesiva para evitar que se saque accidentalmente.Una vez cateterizado, infunda suavemente la solución de Krebs en la vejiga a través del catéter suprapúbico de la vejiga y confirme que el líquido fluye fuera del catéter uretral y no alrededor de él. Cierre la incisión abdominal sobre la vejiga con una sutura de seda 3-0. Coloque una almohadilla base absorbente en una almohadilla térmica para mantener el calor corporal y absorber líquidos.Asegure al animal en la tabla inclinada para ayudar a drenar el líquido intravesical a través del catéter uretral, luego encienda la almohadilla térmica. Conecte el catéter suprapúbico a una llave de parada de tres vías que conecte el catéter a una bomba de jeringa y un transductor de presión. Conecte el transductor de presión a una computadora a través de un amplificador y un sistema de adquisición de datos.Infundir la solución de Krebs a través del catéter suprapúbico a una velocidad de 0,1 mililitros por minuto, y dejar que el líquido drene a través del catéter uretral durante una hora para eliminar cualquier ATP residual liberado durante los implantes del catéter. Después de este período de lavado, tapa el catéter uretral con un tapón luer lock. Mida la presión en la vejiga y busque un aumento lento de la presión intravesical a una presión de 30 centímetros de agua sin un aumento brusco de la presión, lo que indica una contracción de la vejiga.Retire el tapón del catéter uretral cuando la presión alcance los 30 centímetros de agua para evitar daños en la vejiga. Infundir la vejiga y recoger el eluyente del catéter uretral. Pruebe inmediatamente las alícuotas de 100 microlitros del eluyente para detectar ATP o congele para la posterior cuantificación del lote.Para probar el efecto de la distensión vesical en las concentraciones luminales de ATP, tapa el catéter uretral con el tapón y monitorea la presión de la vejiga hasta que alcance el nivel deseado, luego destapa el catéter uretral y recoge el eluyente para la medición o congelación de ATP, como se describió anteriormente. Después de cada distensión, deje que la vejiga descanse y se lave durante 10 a 15 minutos antes de tomar muestras adicionales. Para probar el efecto de los medicamentos en la liberación de ATP, cambie la solución de Krebs que infunde la vejiga a Krebs que contiene el medicamento de elección.Perfundir el medicamento durante 10 a 15 minutos para tener un efecto, y luego recolectar las muestras de vejigas no distendidas y distendidas, como se demostró anteriormente. Coloque 100 microlitros de muestra de perfusión con 50 microlitros de la mezcla de ensayo en el luminómetro para su lectura. Para convertir de unidades de luz relativa a concentración de ATP, haga diluciones seriadas de ATP en solución de Krebs que van desde un micromolar a 10 picomolar en diluciones diez veces mayores para crear una curva estándar, y léalas en el luminómetro.Trazar las lecturas resultantes en un gráfico y realizar una regresión no lineal para extrapolar las concentraciones de las muestras tomadas del animal. La infusión de la solución en la vejiga mientras el catéter uretral está tapado hace que la presión intravesical aumente bruscamente a medida que la vejiga se contrae. Después de la administración de hexametonio, se observó un aumento más gradual de la presión intravesical, lo que permitió que la presión aumentara hasta 30 centímetros de agua sin contracción.El FCF azul brillante disminuye significativamente la pendiente de la curva estándar, suficiente para alterar los valores calculados para la concentración de ATP en la muestra. El cálculo de la concentración de ATP en una muestra utilizando el estándar de Krebs que contiene FCF azul brillante puede resultar en una subestimación de la concentración de ATP en un 50%La distensión de la vejiga aumenta las concentraciones luminales de ATP, que pueden disminuir en presencia de NTPDasa apvrasa, o aumentar cuando las ECA endógenas de NTPD se inhiben con ARL67156. Se analizó la liberación de ATP inducida por el estiramiento del urotelio.La liberación de ATP evocada por distensión es bloqueada por los antagonistas del canal de panectina, FCF azul brillante y carbonoxolona, pero no con un antagonista del canal de conexones, ácido alfa-glicirretínico 18. Es imperativo que todas las lecturas del luminómetro se conviertan a concentraciones de ATP utilizando la curva estándar apropiada, ya que la reacción de Lucifer Luciferase es altamente susceptible a la interferencia de una amplia variedad de agentes diferentes. Nuestra técnica podría usarse para estudiar la liberación evocada por distensión de cualquier molécula en el lumen de la vejiga, suponiendo que exista un ensayo adecuado para esa molécula.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

El uso de la cistometría en pequeños roedores: un estudio de la vejiga chemosensation

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Investigación

Medicina

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Telemetría intrauterina para medir la presión del ratón contráctil<em&gt; En Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Evaluación transcutánea de la función renal en roedores Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Uso de una biopsia química para la evaluación de la calidad del injerto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...