Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) till JMB (DK117884).

Alla procedurer som utförs på gnagare måste följa gällande riktlinjer och godkännas av den lokala institutionella etikprövningskommittén. Experimenten som utfördes för detta manuskript utfördes i enlighet med National Research Council's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Pittsburgh School of Medicine. Se figur 1 för en modifierad version av standardinställningen för cystometri ...

<ol>
	<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+urinary+tract+in+health+and+disease.">Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease.</a> Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Autonomic Neuroscience: Basic &amp; Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).</li><li>Silva-Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+may+be+a+dynamic+biomarker+of+detrusor+overactivity+in+women+with+overactive+bladder+syndrome.">Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome.</a> PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).</li><li>Sun, Y., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+extracellular+ATP+signaling+in+bladder+urothelial+cells+from+patients+with+interstitial+cystitis.">Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).</li><li>Gill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+as+an+indicator+of+infection+and+inflammation+of+the+urinary+tract+in+patients+with+lower+urinary+tract+symptoms.">Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms.</a> BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).</li><li>S&#228;ve, S., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+and+P2Y+receptor+activation+induce+a+proinflammatory+host+response+in+the+human+urinary+tract.">Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).</li><li>Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overactive+and+underactive+bladder+dysfunction+is+reflected+by+alterations+in+urothelial+ATP+and+NO+release.">Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release.</a> Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).</li><li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder.">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).</li><li>Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+long-term+culture+of+differentiated+normal+rat+urothelial+cells+in+vitro.">Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).</li><li>Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+instillation+procedure+in+adult+male+mouse.">Transurethral instillation procedure in adult male mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).</li><li>Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+in+a+small+animal+model:+Transurethral+catheterization+of+male+and+female+mice.">Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).</li><li>Uvin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cystometry+in+small+rodents:+a+study+of+bladder+chemosensation.">The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).</li><li>Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+oxidation+of+luciferin+without+luciferase+and+the+mechanism+of+bioluminescence.">Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence.</a> Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

Majoriteten av forskningen om urotelial ATP-frisättning utförs i odlade celler, med användning av antingen odödliga cellinjer eller primära kulturer av gnagare urotelceller. Medan dessa modeller har fördelen av att vara relativt hög genomströmning (dvs en kultur / passage kan göra många plattor / rätter av celler), minskar deras fysiologiska relevans på grund av: 1) urotelcellernas oförmåga att växa polariserade om de inte odlas på speciella stöd och 2) svårigheten att utsätta odlade celler för fysiol...

Urin ATP tros spela en betydande sensorisk roll i kontrollen av urinering1. Till exempel är det tänkt att ATP frigörs från urotelet som svar på distension där det kan verka på receptorer på blåsans afferenta nerver för att öka deras excitabilitet, vilket leder till känslor av fullhet2. Således är det också tänkt att urin ATP kan vara en viktig aktör i utvecklingen av blåspatologier. Till stöd för denna hypotes är ATP-koncentrationerna i urinen signifikant ökade hos patienter som lider av överaktiv blåsa (OAB)3, blåssmärtsyndrom/interstitiell cystit (BPS/IC)4 eller urinvägsinfektion (UTI)5,6, alla tillstånd som kännetecknas av ökad brådska, frekvens och ibland smärta. Omvänt har patienter som lider av underaktiv blåsa (UAB), som kännetecknas av en oförmåga att tömma blåsan och ibland kan inkludera en minskad förmåga att känna blåsans fullhet, visat sig ha minskade ATP-koncentrationer i urinen7. Experimentellt, manipulation av urin ATP-koncentrationer kan förändra urinblåsan reflexer i råtta; ökande ATP-koncentrationer genom att blockera endogena ATPaser i blåsans lumen kan öka tömningsfrekvensen, medan minskande ATP-koncentrationer genom att införa exogena ATPaser i urinblåsan minskar tömningsfrekvensen8. Således är betydelsen av urin ATP till blåsfunktionen tydlig.
Med tanke på den uppenbara betydelsen av urin ATP till urinblåsans patologi är noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning ett viktigt steg för att förstå de mekanismer som styr frisättning. Många studier har genomförts med olika experimentella modeller för att mäta urotelial ATP-frisättning. Främst bland dessa är cellkulturer, antingen primära kulturer eller cellinjer. Användningen av odlade urotelceller kompliceras emellertid av det faktum att urotelceller inte tar på sig sin fysiologiska polariserade morfologi om de inte odlas på speciella permeabla membran (såsom Transwell-teknik [brunnsinsatser])9. Således är det svårt att relatera någon ATP-frisättning uppmätt till fysiologi. Urotelceller odlade på brunnsinsatser kan polarisera och bilda en barriär som liknar vad som ses in vivo; Tillväxten av ett helt differentierat urotel kan emellertid ta dagar eller veckor. Dessutom, medan det är möjligt att montera brunnsinsatser i en Ussing-kammare och applicera tryck på den apikala sidan för att orsaka sträckning, är det svårt att applicera tillräckligt med tryck för att efterlikna förhållandena inuti blåsan under patologi (dvs tryck på 30 cmH2Oeller högre). Hela blåsvävnaden kan också monteras i en Ussing-kammare för stretchexperiment, men detta tar bort blåsan från organismen tillsammans med de trofiska faktorerna som upprätthåller urotelcellhälsan och därmed urotelbarriärfunktionen. Därför är det mest fysiologiskt relevanta sättet att studera frisättningen av ATP från urotelet som svar på stretch eller tryck in vivo. De kirurgiska tekniker som behövs för att sätta upp experimentet är identiska med dem som vanligtvis används i djurcystometri och bör därför enkelt utföras av alla som är bekanta med den tekniken.
I detta protokoll kommer vi att beskriva tekniken som används för att undersöka luminal ATP hos kvinnliga Sprague Dawley-råttor som väger cirka 200-250 g, eftersom den transuretrala kateteriseringen som beskrivs nedan är mycket lättare hos kvinnor; Transuretral kateterisering kan emellertid också utföras hos manliga gnagare10. Eftersom transuretral kateterisering nu har utförts även hos möss av båda könen11, kan dessa experiment enkelt anpassas för möss eller råttor av båda könen eller av varierande storlek, beroende på forskargruppens behov.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

ATP, frisatt från urotelet som svar på blåsans distension, tros spela en betydande sensorisk roll i kontrollen av urinering. Därför är noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning i en fysiologisk miljö ett viktigt första steg för att studera mekanismerna som styr purinerg signalering i urinblåsan. Befintliga tekniker för att studera mekaniskt framkallad urotelial ATP-frisättning använder odlade celler pläterade på flexibla stöd eller blåsvävnad fäst i Ussing-kamrar; Var och en av dessa tekniker efterliknar emellertid inte helt förhållandena i den intakta blåsan. Därför utvecklades en experimentell inställning för att direkt mäta ATP-koncentrationer i lumen i gnagarens urinblåsa.
I denna inställning perfuseras blåsorna hos bedövade gnagare genom katetrar i både blåsans kupol och via den yttre urinrörsöppningen. Trycket i urinblåsan ökas genom att täcka urinrörskatetern medan den perfuserar steril vätska i blåsan genom kupolen. Mätning av intravesikalt tryck uppnås med hjälp av en tryckgivare fäst vid blåsans kupolkateter, liknande den inställning som används för cystometri. När önskat tryck har uppnåtts avlägsnas urinrörskateterns lock och vätska samlas upp för ATP-kvantifiering genom luciferin-luciferasanalys. Genom denna experimentella uppställning kan mekanismerna som styr både mekanisk och kemisk stimulering av urotelial ATP-frisättning undersökas genom att inkludera olika agonister eller antagonister i perfusatet eller genom att jämföra resultat mellan vildtyp och genetiskt modifierade djur.

Det beskrivna protokollet möjliggör noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning in vivo från blåsans lumen med användning av en modifierad version av standardinställningen för gnagarecystometri (se figur 1). Detta gör det möjligt för forskaren att undersöka effekterna av läkemedel på sträckmedierad ATP-frisättning i en fysiologisk miljö.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_uplo...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Detta protokoll beskriver proceduren för mätning av ATP-koncentrationer i blåsans lumen i en bedövad gnagare.

In vivo Luminal mätning av distension-framkallad urotelial ATP-frisättning hos gnagare

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Vårt protokoll mäter ATP, en viktig sändare i urinblåsan, vilket gör att vi ytterligare kan förhöra mekanismerna som styr dess frisättning. Vår teknik mäter ATP direkt från blåsans lumen, vilket gör det mer fysiologiskt relevant än tekniker som använder odlade celler eller blåsvävnad. Demonstrerar proceduren kommer att vara Keara Healy och Stephanie Daugherty, forskningstekniker i mitt laboratorium.Börja med att inducera initial anestesi genom att placera djuret i en sluten låda gasad med 4% till 5% isofluran i syre. Administrera uretan bilateralt subkutant och placera sedan djuret i en bur så att uretan kan träda i kraft i nästan två timmar. Efter att ha väntat på att uretan ska träda i kraft, testa för ett ordentligt anestesiplan genom att klämma djurets fot med pincett.För att förhindra sammandragning av blåsan som svar på distension under experimentet, injicera djuret med ett ganglioniskt blockerande medel, hexametonium. Applicera sedan oftalmisk salva på djurets ögon för att förhindra torkning under experimentet. Raka nu djurets buk och utför en laparotomi i mittlinjen för att exponera urinblåsan.Använd en flamma, blossa ena änden av en kort längd av PE50 intramedicinsk slang, placera en 22-gauge nål i den andra änden av slangen och fyll den med Krebs-lösning. Placera en liten slinga av 3-0 silkesutur över blåsans kupol och utför en liten cystostomi för att sätta in kateterns utsvängda ände. Medan du håller katetern med ena handen, dra åt suturslingan för att säkra katetern på plats med den andra handen.Avsluta säkringen av katetern genom att knyta två knutar i suturen. Dra katetern tillbaka tills det utsvängda huvudet är i kontakt med blåsväggen. Testa installationen för läckor genom att införa en liten mängd Krebs-lösning genom katetern.Doppa änden av en IV-kateter i kirurgiskt smörjmedel. Håll den yttre urinrörsmeatusen försiktigt med ett par pincett och sätt in kateterns spets i urinrörsöppningen i svansens riktning, som beskrivs i manuskriptet. Vrid katetern 90 grader och gå försiktigt framåt.Sätt in katetern tills luerlåsnavet är fem millimeter distalt från den yttre urinrörsöppningen. Säkra katetern och förhindra läckage runt katetern genom att slinga en kort längd av 3-0 silkesutur runt den yttre urinrörsmeatus och binda den tätt. Fäst katetern i svansen med tejp för att förhindra att den av misstag dras ut.När kateteriserat, infusera försiktigt Krebs-lösningen i urinblåsan genom den suprapubiska blåskatetern och bekräfta att vätskan rinner ut ur urinrörskatetern och inte runt den. Stäng buksnittet över urinblåsan med en 3-0 silkesutur. Placera en absorberande underplatta på en värmedyna för att bibehålla kroppsvärmen och absorbera vätska.Säkra djuret på det lutande brädet för att hjälpa till att dränera intravesikal vätska genom urinrörskatetran och sätt sedan på värmedynan. Anslut den suprapubiska katetern till en trevägs stoppkran som ansluter katetern till en sprutpump och en tryckgivare. Anslut tryckgivaren till en dator via en förstärkare och ett datainsamlingssystem.Infusera Krebs-lösningen genom den suprapubiska katetern med en hastighet av 0,1 ml per minut och låt vätskan rinna genom urinrörskatetern i en timme för att tvätta bort eventuell kvarvarande ATP som frigörs under kateterimplantationerna. Efter denna wash-out period, täck urinrörskatetern med en luer lockplugg. Mät trycket i blåsan och leta efter en långsam ökning av det intravesiska trycket till ett tryck på 30 centimeter vatten utan en kraftig ökning av trycket, vilket indikerar en blåskontraktion.Ta bort pluggen från urinrörskatetern när trycket når 30 centimeter vatten för att förhindra skador på urinblåsan. Infusera blåsan och samla eluenten från urinrörskatetern. Testa 100 mikroliter alikvoter av eluenten omedelbart för ATP eller frys för senare satskvantifiering.För att testa effekten av blåsans utspänning på luminala ATP-koncentrationer, täck urinrörskatetern med pluggen och övervaka blåstrycket tills den når önskad nivå, lossa sedan urinrörskatetern och samla eluenten för ATP-mätning eller frysning, som beskrivits ovan. Efter varje distension låt blåsan vila och tvätta ut i 10 till 15 minuter innan du tar ytterligare prover. För att testa effekten av läkemedel vid frisättning av ATP, byt Krebs-lösningen som infunderar blåsan till Krebs som innehåller det valfria läkemedlet.Perfusera läkemedlet i 10 till 15 minuter för att få effekt och samla sedan proverna från icke-utspända och utspända blåsor, som visats tidigare. Placera 100 mikroliter prov av perfusat med 50 mikroliter av analysblandningen i luminometern för avläsning. För att konvertera från relativa ljusenheter till ATP-koncentration, gör seriella utspädningar av ATP i Krebs-lösning som sträcker sig från en mikromolär till 10 picomolar i tiofaldiga utspädningar för att skapa en standardkurva och läs dem i luminometern.Plotta de resulterande avläsningarna på ett diagram och utför en icke-linjär regression för att extrapolera koncentrationer från proverna som tagits från djuret. Infusion av lösningen i urinblåsan medan urinrörskatetern är pluggad gör att intravesikalt tryck stiger kraftigt när blåsan kontraherar. Efter administrering av hexameton observerades en mer gradvis ökning av intravesikalt tryck, vilket gjorde att trycket kunde stiga så högt som 30 centimeter vatten utan sammandragning.Briljantblått FCF minskar signifikant standardkurvans lutning, tillräckligt för att ändra de beräknade värdena för koncentrationen av ATP i provet. Beräkning av koncentrationen av ATP i ett prov med hjälp av Krebs-standarden som innehåller briljantblått FCF kan resultera i en underskattning av ATP-koncentrationen med 50%Utspänning av blåsan ökar luminala ATP-koncentrationer, som kan minskas i närvaro av NTPDasapvrase, eller ökas när endogena NTPD ACE hämmas med ARL67156. Den sträckinducerade ATP-frisättningen från urotelet analyserades.Distension-framkallad ATP-frisättning blockeras av panectinkanalantagonisterna, lysande blå FCF och karbonoxolon, men inte med en konnexonkanalantagonist, 18 alfa-glycyrrhetinsyra. Det är absolut nödvändigt att alla luminometeravläsningar omvandlas till koncentrationer av ATP med hjälp av lämplig standardkurva, eftersom Lucifer Luciferas-reaktionen är mycket mottaglig för störningar av en mängd olika medel. Vår teknik kan användas för att studera distension-framkallad frisättning av vilken molekyl som helst i blåsans lumen, förutsatt att en lämplig analys för den molekylen existerar.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Mätning av mus Pulmonary Endothelial ytskikt

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Näthinneavlossning modell i gnagare genom subretinal Injektion av natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI för Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Långsam frisättning Drug Delivery genom Elvax 40W till Rat Retina: Konsekvenser för behandling av kroniska sjukdomar

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Fjärr Limb Ischemisk Förkonditionering: neuroprotektiv Teknik Gnagare

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetry att mäta Mouse kontraktila Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transkutan bedömning av njurfunktion i medvetna Gnagare

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Förberedelsesteg för mätning av reaktivitet i mus Retinal arterioler Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Använda en kemisk biopsi för graft kvalitetsbedömning

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...