Name: in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents
Uploaded: 2022-09-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü'nden (NIDDK) JMB'ye (DK117884) verilen bir hibe ile desteklenmiştir.

Kemirgenlerde gerçekleştirilen tüm prosedürler geçerli kılavuzlara uymalı ve yerel kurumsal etik inceleme komitesi tarafından onaylanmalıdır. Bu makale için yapılan deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Pittsburgh Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan standart kemirgen sistometri kurulumunun değiştiri...

<ol>
	<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+urinary+tract+in+health+and+disease.">Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease.</a> Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).</li><li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+signaling.">Urothelial signaling.</a> Autonomic Neuroscience: Basic &amp; Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).</li><li>Silva-Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+may+be+a+dynamic+biomarker+of+detrusor+overactivity+in+women+with+overactive+bladder+syndrome.">Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome.</a> PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).</li><li>Sun, Y., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+extracellular+ATP+signaling+in+bladder+urothelial+cells+from+patients+with+interstitial+cystitis.">Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).</li><li>Gill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+ATP+as+an+indicator+of+infection+and+inflammation+of+the+urinary+tract+in+patients+with+lower+urinary+tract+symptoms.">Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms.</a> BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).</li><li>S&#228;ve, S., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+and+P2Y+receptor+activation+induce+a+proinflammatory+host+response+in+the+human+urinary+tract.">Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).</li><li>Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overactive+and+underactive+bladder+dysfunction+is+reflected+by+alterations+in+urothelial+ATP+and+NO+release.">Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release.</a> Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).</li><li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder.">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).</li><li>Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+long-term+culture+of+differentiated+normal+rat+urothelial+cells+in+vitro.">Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).</li><li>Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transurethral+instillation+procedure+in+adult+male+mouse.">Transurethral instillation procedure in adult male mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).</li><li>Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+in+a+small+animal+model:+Transurethral+catheterization+of+male+and+female+mice.">Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).</li><li>Uvin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cystometry+in+small+rodents:+a+study+of+bladder+chemosensation.">The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).</li><li>Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+inhibition.">Firefly luciferase inhibition.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mechanism+for+nonspecific+activation+in+reporter-gene+assays.">A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays.</a> ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).</li><li>Harvey, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+oxidation+of+luciferin+without+luciferase+and+the+mechanism+of+bioluminescence.">Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence.</a> Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+brilliant+blue+FCF+and+carmoisine+in+food+samples+by+aqueous+two-phase+system+and+spectrophometric+detection.">Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection.</a> Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).</li></ol>

Ürotelyal ATP salınımı ile ilgili araştırmaların çoğu, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları veya kemirgen ürotelyal hücrelerinin birincil kültürleri kullanılarak kültürlenmiş hücrelerde gerçekleştirilir. Bu modeller nispeten yüksek verim avantajına sahip olsa da (yani, bir kültür / pasaj birçok tabak / hücre tabağı yapabilir), fizyolojik alaka düzeyleri şunlardan dolayı azalır: 1) ürotelyal hücrelerin özel destekler üzerinde yetiştirilmedikçe polarize büyüyememesi ve 2) kültür...

Üriner ATP'nin miksiyonkontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir 1. Örneğin, ATP'nin, uyarılabilirliklerini arttırmak için mesane afferent sinirleri üzerindeki reseptörler üzerinde hareket edebileceği ve dolgunluk hissine yol açabileceği distansiyona yanıt olarak ürotelyumdan salındığı düşünülmektedir2. Bu nedenle, idrar ATP'sinin mesane patolojilerinin gelişiminde önemli bir oyuncu olabileceği düşünülmektedir. Bu hipotezi desteklemek için, aşırı aktif mesane (OAB)3, mesane ağrısı sendromu/interstisyel sistit (BPS/IC)4 veya idrar yolu enfeksiyonu (İYE)5,6 şikayeti olan hastalarda, artan aciliyet, sıklık ve bazen ağrı ile karakterize tüm durumlarda, üriner ATP konsantrasyonları anlamlı olarak artmıştır. Tersine, mesanesini boşaltamamakla karakterize olan ve bazen mesane dolgunluğunu algılama yeteneğinin azalmasını içerebilen düşük aktif mesaneden (UAB) muzdarip hastaların, idrar ATP konsantrasyonlarının azaldığı gösterilmiştir7. Deneysel olarak, idrar ATP konsantrasyonlarının manipülasyonu sıçandaki mesane reflekslerini değiştirebilir; Mesane lümenindeki endojen ATPazları bloke ederek ATP konsantrasyonlarının arttırılması işeme sıklığını artırabilirken, mesaneye eksojen ATPazlar aşılayarak ATP konsantrasyonlarını azaltmak işeme sıklığını azaltır8. Bu nedenle, idrar ATP'sinin mesane fonksiyonu için önemi açıktır.
Üriner ATP'nin mesane patolojisi için belirgin önemi göz önüne alındığında, ürotelyal ATP salınımının doğru ölçülmesi, salınımı kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir adımdır. Ürotelyal ATP salınımını ölçmek için farklı deneysel modeller kullanılarak birçok çalışma tamamlanmıştır. Bunların başında hücre kültürleri, birincil kültürler veya hücre hatları gelir. Bununla birlikte, kültürlenmiş ürotelyal hücrelerin kullanımı, ürotelyal hücrelerin özel geçirgen membranlarda (Transwell teknolojisi [kuyu ekleri] gibi) yetiştirilmedikçe fizyolojik polarize morfolojilerini üstlenmemeleri nedeniyle karmaşıktır9. Bu nedenle, ölçülen herhangi bir ATP salınımını fizyoloji ile ilişkilendirmek zordur. Kuyu uçlarında yetişen ürotelyal hücreler polarize olabilir ve in vivo görülene benzer bir bariyer oluşturabilir; Bununla birlikte, tamamen farklılaşmış bir ürotelyumun büyümesi günler veya haftalar sürebilir. Ek olarak, kuyu uçlarını bir Ussing odasına monte etmek ve gerilmeye neden olmak için apikal tarafa basınç uygulamak mümkün olsa da, patoloji sırasında mesanenin içindeki koşulları taklit etmek için yeterli basınç uygulamak zordur (yani, 30 cmH2O veya üzeri basınçlar). Tüm mesane dokusu, streç deneyleri için bir Ussing odasına da monte edilebilir, ancak bu, ürotelyal hücre sağlığını ve dolayısıyla ürotelyal bariyer fonksiyonunu koruyan trofik faktörlerle birlikte mesaneyi organizmadan uzaklaştırır. Bu nedenle, gerilme veya basınca yanıt olarak ürotelyumdan ATP salınımını incelemenin fizyolojik olarak en alakalı yolu in vivo'dur. Deneyi kurmak için gereken cerrahi teknikler, hayvan sistometrisinde yaygın olarak kullanılanlarla aynıdır ve bu nedenle, bu tekniğe aşina olan herkes tarafından kolayca uygulanmalıdır.
Bu protokolde, yaklaşık 200-250 g ağırlığındaki dişi Sprague Dawley sıçanlarında luminal ATP'yi incelemek için kullanılan tekniği açıklayacağız, çünkü aşağıda açıklanan transüretral kateterizasyon kadınlarda çok daha kolaydır; Bununla birlikte, transüretral kateterizasyon erkek kemirgenlerde de yapılabilir10. Transüretral kateterizasyon artık her iki cinsiyetteki farelerde de11 yapıldığından, bu deneyler araştırma ekibinin ihtiyaçlarına bağlı olarak, cinsiyetteki veya farklı boyutlardaki fareler veya sıçanlar için kolayca uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>FLAA-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition system/ software</td>
			<td>DataQ Instruments</td>
			<td>DI-1100</td>
			<td>Software included, requires Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethonium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>H0879</td>
			<td>20 mg/kg dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lidocaine</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>2468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock plugs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0455253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (GloMax 20/20)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE50) tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 33 DDS syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure transducers</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>multiple numbers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sur-Vet I.V. catheter&#160;</td>
			<td>Covetrus North America</td>
			<td>50603</td>
			<td>20 G x 1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tiltable surgical table (Plas Labs)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-19E</td>
			<td>allows Luer-Lock connectors to attach to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td>U2500</td>
			<td>0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo luminal measurement of distension-evoked urothelial atp release in rodents

Mesane distansiyonuna yanıt olarak ürotelyumdan salınan ATP'nin, işitasyonun kontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir. Bu nedenle, ürotelyal ATP salınımının fizyolojik bir ortamda doğru ölçülmesi, idrar kesesinde pürinerjik sinyalleşmeyi kontrol eden mekanizmaların incelenmesinde önemli bir ilk adımdır. Mekanik olarak uyarılmış ürotelyal ATP salınımını incelemek için mevcut teknikler, esnek destekler üzerine kaplanmış kültürlü hücreleri veya Ussing odalarına sabitlenmiş mesane dokusunu kullanır; Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri, sağlam mesanedeki koşulları tam olarak taklit etmez. Bu nedenle, kemirgen idrar kesesinin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını doğrudan ölçmek için deneysel bir kurulum geliştirilmiştir.
Bu kurulumda, anestezi uygulanan kemirgenlerin mesaneleri, hem mesanenin kubbesindeki kateterlerden hem de dış üretral delikten geçirilir. Mesanedeki basınç, üretral kateterin kapatılmasıyla arttırılırken, steril sıvının kubbe yoluyla mesaneye nüfuz ettirilmesiyle arttırılır. İntravezikal basıncın ölçümü, sistometri için kullanılan kuruluma benzer şekilde, mesane kubbe kateterine bağlı bir basınç transdüseri kullanılarak gerçekleştirilir. İstenilen basınca ulaşıldıktan sonra, üretral kateter kapağı çıkarılır ve lusiferin-lusiferaz testi ile ATP nicelleştirmesi için sıvı toplanır. Bu deney düzeneği sayesinde, ürotelyal ATP salınımının hem mekanik hem de kimyasal stimülasyonunu kontrol eden mekanizmalar, perfüzyona çeşitli agonistler veya antagonistler dahil edilerek veya vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar arasındaki sonuçlar karşılaştırılarak sorgulanabilir.

Tarif edilen protokol, standart kemirgen sistometri kurulumunun modifiye edilmiş bir versiyonunu kullanarak, mesanenin lümeninden ürotelyal ATP salınımının in vivo olarak doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar (bkz. Şekil 1). Bu, araştırmacının ilaçların fizyolojik bir ortamda streç aracılı ATP salınımı üzerindeki etkilerini incelemesini sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents at JoVE.com

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

Bu protokol, anestezi uygulanan bir kemirgende mesanenin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını ölçme prosedürünü açıklar.

İn Vivo Kemirgenlerde Distansiyon Uyarılmış Ürotelyal ATP Salınımının Luminal Ölçümü

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Protokolümüz, idrar kesesinde önemli bir verici olan ATP'yi ölçer ve bu da serbest bırakılmasını kontrol eden mekanizmaları daha fazla sorgulamamıza izin verir. Tekniğimiz ATP'yi doğrudan mesane lümeninden ölçerek, kültürlenmiş hücreleri veya mesane dokusunu kullanan tekniklerden daha fizyolojik olarak daha alakalı hale getirir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki araştırma teknisyenleri Keara Healy ve Stephanie Daugherty olacak.Başlamak için, hayvanı oksijende% 4 ila% 5 izofluran ile gazlanmış kapalı bir kutuya yerleştirerek ilk anesteziyi indükleyin. Deri altından üretanı iki taraflı olarak uygulayın, ardından üretanın neredeyse iki saat boyunca etkili olmasına izin vermek için hayvanı bir kafese yerleştirin. Üretanın etkili olmasını bekledikten sonra, forseps kullanarak hayvanın ayağını sıkıştırarak uygun bir anestezi düzlemini test edin.Deney sırasında distansiyona yanıt olarak mesanenin kasılmasını önlemek için, hayvana gangliyonik bloke edici bir ajan olan heksametonyum enjekte edin. Daha sonra, deney sırasında kurumayı önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem uygulayın. Şimdi hayvanın karnını tıraş edin ve idrar kesesini ortaya çıkarmak için orta hat laparotomi yapın.Bir alev kullanarak, kısa bir PE50 intramedik borunun bir ucunu parlatın, borunun diğer ucuna 22 gauge'lik bir iğne yerleştirin ve Krebs çözeltisi ile doldurun. Mesanenin kubbesinin üzerine 3-0 ipek dikişten oluşan küçük bir halka yerleştirin ve kateterin alevli ucunu yerleştirmek için küçük bir sistostomi uygulayın. Kateteri bir elinizle tutarken, kateteri diğer elinizle yerine sabitlemek için dikiş halkasını sıkın.Dikişe iki düğüm bağlayarak kateteri sabitlemeyi bitirin. Parlayan kafa mesane duvarıyla temas edene kadar kateteri geri çekin. Kateterden az miktarda Krebs çözeltisi enjekte ederek sızıntı için kurulumu test edin.IV kateterin ucunu cerrahi kayganlaştırıcıya batırın. Dış üretral meatusu bir çift forseps ile nazikçe tutun ve kateterin ucunu üretral deliğe el yazmasında açıklandığı gibi kuyruk yönünde yerleştirin. Kateteri 90 derece döndürün ve yavaşça ilerleyin.Kateteri, luer kilit göbeği dış üretral açıklıktan beş milimetre distal olana kadar yerleştirin. Kateteri sabitleyin ve dış üretral meatusun etrafına kısa bir 3-0 ipek sütür ilmek ilmek ilmek ilmek ve sıkıca bağlayarak kateterin etrafındaki sızıntıyı önleyin. Kateteri yanlışlıkla dışarı çekilmesini önlemek için kuyruğa bantla sabitleyin.Kateterize edildikten sonra, Krebs çözeltisini suprapubik mesane kateteri yoluyla mesaneye nazikçe enjekte edin ve sıvının üretral kateterden dışarı aktığını ve etrafından akmadığını doğrulayın. Mesane üzerindeki karın kesisini 3-0 ipek dikiş kullanarak kapatın. Vücut ısısını korumak ve sıvıyı emmek için bir ısıtma yastığına emici bir alt ped yerleştirin.İntravezikal sıvının üretral kateterden boşaltılmasına yardımcı olmak için hayvanı eğimli tahtaya sabitleyin, ardından ısıtma yastığını açın. Suprapubik kateteri, kateteri bir şırınga pompasına ve bir basınç dönüştürücüsüne bağlayan üç yönlü bir durdurma horozuna bağlayın. Basınç dönüştürücüsünü bir amplifikatör ve bir veri toplama sistemi aracılığıyla bir bilgisayara bağlayın.Krebs çözeltisini suprapubik kateterden dakikada 0.1 mililitre oranında infüze edin ve kateter implantasyonları sırasında salınan artık ATP'yi yıkamak için sıvının bir saat boyunca üretral kateterden akmasına izin verin. Bu yıkama süresinden sonra, üretral kateteri bir luer kilit tapası kullanarak kapatın. Mesanedeki basıncı ölçün ve intravezikal basınçta, basınçta keskin bir artış olmadan 30 santimetre su basıncına yavaş bir artış olup olmadığına bakın, bu da mesane kasılmasını gösterir.Mesanenin zarar görmesini önlemek için basınç 30 santimetre suya ulaştığında tıkacı üretral kateterden çıkarın. Mesaneyi infüze edin ve üretral kateterden elüenti toplayın. Eletentin 100 mikrolitrelik alikotlarını ATP için hemen test edin veya daha sonraki parti miktarı için dondurun.Mesane distansiyonunun luminal ATP konsantrasyonları üzerindeki etkisini test etmek için, üretral kateteri tıkaç ile kapatın ve istenen seviyeye ulaşana kadar mesane basıncını izleyin, ardından üretral kateterin kapağını açın ve yukarıda açıklandığı gibi ATP ölçümü veya donma için elüenti toplayın. Her distansiyondan sonra, ek örnekler almadan önce mesanenin dinlenmesine ve 10 ila 15 dakika yıkanmasına izin verin. İlaçların ATP salınımı üzerindeki etkisini test etmek için, mesaneyi infüze eden Krebs çözeltisini, seçilen ilacı içeren Krebs'e geçirin.Bir etkiye sahip olmak için ilacı 10 ila 15 dakika boyunca perfüze edin ve daha sonra daha önce gösterildiği gibi, şişkin olmayan ve şişmiş mesanelerden örnekleri toplayın. Okumak için luminometreye 50 mikrolitre tahlil karışımı ile 100 mikrolitre perfüzyonat örneği yerleştirin. Göreceli ışık birimlerinden ATP konsantrasyonuna dönüştürmek için, standart bir eğri oluşturmak için Krebs çözeltisinde ATP'nin on kat seyreltmede bir mikromolar ila 10 pikomolar arasında değişen seri seyreltmelerini yapın ve bunları luminometrede okuyun.Elde edilen okumaları bir grafik üzerinde çizin ve hayvandan alınan örneklerden konsantrasyonları tahmin etmek için doğrusal olmayan bir regresyon gerçekleştirin. Üretral kateter tıkanırken çözeltinin mesaneye infüzyonu, mesane kasıldıkça intravezikal basıncın keskin bir şekilde yükselmesine neden olur. Heksametonyum uygulamasından sonra, intravezikal basınçta daha kademeli bir artış gözlendi ve basıncın büzülmeden 30 santimetre suya kadar yükselmesine izin verildi.Parlak mavi FCF, numunedeki ATP konsantrasyonu için hesaplanan değerleri değiştirmeye yetecek kadar standart eğrinin eğimini önemli ölçüde azaltır. Parlak mavi FCF içeren Krebs standardını kullanarak bir numunedeki ATP konsantrasyonunun hesaplanması, ATP konsantrasyonunun% 50 oranında hafife alınmasına neden olabilir, mesanenin distansiyonu, NTPDaz apvraz varlığında azaltılabilen veya endojen NTPD ACE'ler ARL67156 ile inhibe edildiğinde artabilen luminal ATP konsantrasyonlarını arttırır. Ürotelyumdan gerilmeye bağlı ATP salınımı analiz edildi.Distansiyonla uyarılan ATP salınımı panektin kanal antagonistleri, parlak mavi FCF ve karbonoksolon tarafından bloke edilir, ancak bir konnekson kanal antagonisti olan 18 alfa-glisiretinik asit ile bloke edilmez. Lucifer Luciferaz reaksiyonu, çok çeşitli farklı ajanların müdahalesine karşı oldukça hassas olduğundan, tüm luminometre okumalarının uygun standart eğri kullanılarak ATP konsantrasyonlarına dönüştürülmesi zorunludur. Tekniğimiz, mesanenin lümenindeki herhangi bir molekülün distansiyon ile uyarılmış salınımını incelemek için kullanılabilir, bu molekül için uygun bir tahlilin mevcut olduğu varsayılarak.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Sodyum Hyaluronat subretinal Enjeksiyon Kemirgenler Retina Dekolmanı Modeli

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Rat Retina için Elvax 40W ile yavaş salınımlı İlaç Dağıtım: Kronik Koşullar Tedavisinde Etkileri

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullanma: Kemirgenler Bir Nöroprotektiftir Tekniği

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Rahim içi Telemetri Fare Kontraktil Basıncını Ölçmek<em&gt; İn Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Bilinçli Kemirgenler Böbrek Fonksiyon Transkutanöz Değerlendirmesi

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Fare retina arteriyoller Ex Vivo reaktivite ölçümü için hazırlık adımları

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Greft Kalite Değerlendirmesi için Kimyasal Biyopsi Kullanımı

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...