असमर्थ मोटर-संचालित गतिशीलता और यांत्रिकी के साथ एक्टिन-माइक्रोट्यूबुल्स कंपोजिट का पुनर्गठन और विशेषता

हमारा काम साइटोस्केलेटन पुनर्गठन प्रयासों को एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के इंजीनियरिंग कंपोजिट द्वारा सेलुलर स्थितियों की नकल करने के करीब एक महत्वपूर्ण कदम लाता है, जो सक्रिय रूप से ट्यून, पुनर्गठन और स्थानांतरित करने के लिए किनेसिन और मायोसिन मोटर्स द्वारा संचालित होता है। हमारे कंपोजिट की गतिशीलता और संरचना को संकुचन, संक्रमण, डिमाइजिंग, मोटेपन और टूटने के समृद्ध चरण आधार को प्रदर्शित करने के लिए विभिन्न घटकों को स्वतंत्र रूप से जोड़कर, हटाकर और ट्यून करके सटीक रूप से प्रोग्राम किया जा सकता है। हमारा दृष्टिकोण मोटे तौर पर सक्रिय पदार्थ प्लेटफार्मों को डिजाइन, बनाने और चिह्नित करने के लिए लागू होता है जो कई बल उत्पन्न करने वाले घटकों को शामिल करते हैं जो एक ही प्रणाली में विभिन्न सब्सट्रेट्स पर कार्य करते हैं।

प्रक्रिया का प्रदर्शन डेज़ी अचिरिलोई और माया हेंडिजा करेंगे। हमारी प्रयोगशाला से स्नातक शोधकर्ता। शुरू करने के लिए, अभिकर्मकों को एक बाँझ काले 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें, जिसमें सूक्ष्म पिपेट और बाँझ पिपेट युक्तियों का उपयोग करके किनेसिन मोटर क्लस्टर बनाए जाते हैं जो सूक्ष्मनलिकाएं के जोड़े के बीच बलों को बांधते हैं और बढ़ाते हैं।

घोल को ऊपर और नीचे करके धीरे-धीरे मिलाएं। फिर चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए घोल को इनक्यूबेट करें, इसे प्रकाश से बचाएं। एक्टन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं का एक सह-उलझा हुआ समग्र नेटवर्क तैयार करने के लिए, हीट ब्लॉक को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।

अभिकर्मकों को बाँझ 0.6 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 25 माइक्रोलीटर है। धीरे से घोल को ऊपर और नीचे मिलाने के लिए पिपेट करें और इसे एक घंटे के लिए प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक पर रखें।

उसके बाद, हीट ब्लॉक से ट्यूब को हटा दें और 100 माइक्रोमोलर फेलोइडिन के 0.84 माइक्रोलीटर में धीरे से मिश्रण करने के लिए एक माइक्रो पिपेट का उपयोग करें। प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर पांच से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कॉन्फ फोकल इमेजिंग के लिए सक्रिय कंपोजिट तैयार करने के लिए, अभिकर्मकों को घोल में जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइप करके धीरे-धीरे मिलाएं।

समाधान को तीन 10 माइक्रोलीटर एलिकोट में विभाजित करें और उन्हें के, के प्लस एम और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में लेबल करें। के प्लस एम एलिकोट में मायोसिन के 2.54 माइक्रोलीटर और के में पीईएम के 2.54 माइक्रोलीटर और नकारात्मक नियंत्रण एलिकोट जोड़ें। फिर K और K प्लस M एलिकोट्स में किन्सिन क्लस्टर के 2.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें।

इसके बाद, उसी तकनीक का उपयोग करके नकारात्मक नियंत्रण में पीईएम के 2.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। केशिका क्रिया के माध्यम से नमूना कक्षों के संबंधित चैनल में प्रत्येक समाधान को धीरे-धीरे प्रवाहित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। पाइप पर बहुत धीरे-धीरे और धीरे से धक्का दें ताकि चैनल में हवा के बुलबुले पेश न हों।

तेजी से सूखने वाले एपॉक्सी या यूवी इलाज योग्य गोंद के साथ प्रत्येक चैनल के दो खुले सिरों को सील करें। जब चिपकने वाला पूरी तरह से सूख जाता है, तो समग्र को यथासंभव प्रारंभिक निष्क्रिय अवस्था के करीब चित्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप पर चैनल रखें। पहले के चैनल और के प्लस एम चैनलों को चित्रित करें और उसके बाद नियंत्रण चैनल।

काइन्सिन समूहों को K और K प्लस M एलिकोट में जोड़ने और डेटा अधिग्रहण की शुरुआत के बीच बीत चुके समय पर ध्यान दें। एक्टिन या एए क्रॉसलिंकर के लिए एक्टिन तैयार करने के लिए, बायोटिन-एक्टिन, न्यूट्राविडिन, बायोटिन और पीईएम को माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और उन्हें ऊपर और नीचे पाइप करके धीरे-धीरे मिलाएं। इसी तरह, सूक्ष्मनलिकाएं से सूक्ष्मनलिकाएं या एमएम क्रॉसलिंकर के लिए, एक माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बायोटिन-ट्यूबुलिन, न्यूट्रेविडिन, बायोटिन और पीईएम जोड़ें और उन्हें ऊपर और नीचे पाइप करके धीरे-धीरे मिलाएं।

एक वॉटरटाइट सील बनाने के लिए ट्यूब को थर्मोप्लास्टिक छत फिल्म में लपेटें और उन्हें तापमान नियंत्रित सोनिकेटर स्नान में प्लवनशीलता राफ्ट में रखें, 90 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। इमेजिंग के लिए नमूनों में ए-ए क्रॉसलिंकर कॉम्प्लेक्स को शामिल करने के लिए, अभिकर्मकों को माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 25 माइक्रोलीटर है।

इसी तरह, एम-एम क्रॉसलिंकर कॉम्प्लेक्स के लिए, स्क्रीन पर दिखाए गए अभिकर्मकों को माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। घोल को ऊपर और नीचे करके मिलाएं और इसे एक घंटे के लिए प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक पर रखें। उसके बाद, हीट ब्लॉक से ट्यूब को हटा दें और 100 माइक्रोमोलर फेलोइडिन के 0.84 माइक्रोलीटर में मिश्रण करने के लिए एक माइक्रो पिपेट का उपयोग करें।

प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर पांच से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए सक्रिय कंपोजिट तैयार करने के लिए पहले दिखाई गई प्रक्रिया को दोहराएं। एक्टिन मोनोफाइबर और ट्यूबुलिन डिमर को एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के सह-उलझे हुए नेटवर्क बनाने के लिए सह-बहुलक बनाया जाता है। मायोसिन दो मिनी फिलामेंट्स और किन्सिन क्लस्टर कंपोजिट को स्थिर अवस्था से बाहर निकालने के लिए फिलामेंट्स को धक्का देते हैं और खींचते हैं।

निष्क्रिय क्रॉस-लिंकिंग को बायोटिनिलेटेड एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं जोड़ने के लिए न्यूट्राविडिन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। मायोसिन दो मिनी फिलामेंट्स, किन्सिन क्लस्टर, या दोनों मोटर्स को बिना किसी निष्क्रिय क्रॉसलिंक, एक्टिन-एक्टिन क्रॉसलिंक और माइक्रोट्यूबुल्स-माइक्रोट्यूबुल्स क्रॉसलिंक के साथ कंपोजिट में शामिल किया जाता है। अलग-अलग मायोसिन सांद्रता और मोलर एक्टिन अंशों के साथ मायोसिन संचालित साइटोस्केलेटन कंपोजिट के दो रंग कॉन्फोकल इमेजिंग यहां दिखाए गए हैं।

कण छवि वेलोसिमेट्री से पता चलता है कि एक्टिन मायोसिन गतिविधि सह-उलझे हुए कंपोजिट में एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं की समन्वित सिकुड़ा हुआ गतिशीलता को ट्रिगर करती है। यहां, विभिन्न तीर रंग अलग-अलग गति के अनुरूप हैं जैसा कि वेक्टर फ़ील्ड के दाईं ओर रंग पैमाने में दर्शाया गया है। एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं दोनों के लिए क्षय समय बनाम तरंग संख्या की विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए समय श्रृंखला के सूक्ष्मनलिका और एक्टिन चैनलों पर समय हल किए गए अंतर गतिशील माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया जाता है।

संकुचन की गति क्षय समय वक्रों के माध्यम से निर्धारित की जाती है, जो प्रत्येक 45 मिनट की समय श्रृंखला की पूरी अवधि के लिए सभी अंतराल समय पर औसत होती है। समय हल किए गए अंतर गतिशील माइक्रोस्कोपी यह निर्धारित करता है कि एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के लिए 45 मिनट के सक्रियण समय के दौरान लगातार छह मिनट के अंतराल के लिए क्षय समय का मूल्यांकन करके गतिशीलता समय के साथ कैसे भिन्न होती है। एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के लिए समय हल संकुचन गति को संबंधित क्षय समय वक्रों के लिए फिट से निर्धारित किया जाता है।

स्थानिक छवि ऑटो सहसंबंध विश्लेषण अंत की तुलना में प्रयोग की शुरुआत में विभिन्न नेटवर्क के लिए ऑटो सहसंबंध वक्रों की तुलना करके सक्रिय साइटोस्केलेटल घटकों के मोटर संचालित पुनर्गठन को निर्धारित करता है। ऑटो सहसंबंध वक्रों के घातीय फिट के माध्यम से निर्धारित समय हल सहसंबंध लंबाई कंपोजिट दिखाती है जो काफी हद तक पुनर्गठन करने वालों की तुलना में पुनर्गठन नहीं करती है। किन्सिन संचालित एक्टिन माइक्रोट्यूबुल्स कंपोजिट की दो रंग कंफोकल छवियां क्रॉसलिंकर कंपोजिट के बिना समय के साथ निर्माण निर्भर पुनर्गठन दिखाती हैं।

एक्टिन-एक्टिन क्रॉस-लिंकिंग एक्टिन सूक्ष्मनलिका सह-स्थानीयकरण का समर्थन करता है, जबकि सूक्ष्मनलिका-सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉस-लिंकिंग डी मिश्रण को बढ़ाती है। विभेदक गतिशील माइक्रोस्कोपी और स्थानिक छवि ऑटो सहसंबंध विश्लेषण कंपोजिट की समय-बदलती गतिशीलता और संरचना पर क्रॉस-लिंकिंग और प्रतिस्पर्धी माइसिन और किन्सिन मोटर्स के प्रभाव को दर्शाता है। सेलुलर स्थितियों की अधिक बारीकी से नकल करने के लिए, शोधकर्ता मध्यवर्ती फिलामेंट्स, अन्य मोटर्स और बाध्यकारी प्रोटीन को शामिल कर सकते हैं जो फिलामेंट लंबाई और कठोरता को नियंत्रित करते हैं।

समग्र यांत्रिकी को चिह्नित करने के लिए ऑप्टिकल ट्वीज़र्स मेट्रोलॉजी माप भी किया जा सकता है। हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, शोधकर्ता विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं का अनुकरण करने और पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य प्रोग्राम करने योग्य सामग्रियों को इंजीनियर करने के लिए एक अभूतपूर्व चरण स्थान में साइटोस्केलेटन प्रेरित समग्र सक्रिय पदार्थ की गतिशीलता और संरचना को ठीक से ट्यून कर सकते हैं।