우리의 연구는 키네신 및 미오신 모터에 의해 구동되는 액틴과 미세소관의 복합체를 엔지니어링하여 능동적으로 조정, 구조 조정 및 이동함으로써 세포 골격 재구성 노력을 세포 조건을 모방하는 데 중요한 한 걸음 더 다가가게 합니다. 복합 재료의 역학과 구조는 수축, 감염, 탈모, 조잡함 및 파열의 풍부한 위상 기반을 나타내기 위해 다양한 구성 요소를 독립적으로 추가, 제거 및 조정하여 정밀하게 프로그래밍할 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 단일 시스템에서 서로 다른 기판에 작용하는 여러 힘 생성 구성 요소를 통합하는 활성 물질 플랫폼을 설계, 생성 및 특성화하는 데 광범위하게 적용됩니다.
절차를 시연하는 것은 Daisy Achiriloaie와 Maya Hendija가 될 것입니다. 우리 연구실의 학부 연구원. 먼저 마이크로 피펫과 멸균 피펫 팁을 사용하여 시약을 멸균 검정색 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 미세소관 쌍 사이에 결합하고 힘을 가하는 Kinesin 모터 클러스터를 형성합니다.
용액을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 30 분 동안 용액을 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 액톤 필라멘트와 미세 소관의 얽힌 복합 네트워크를 준비하려면 열 블록을 섭씨 37도로 설정하십시오.
시약을 멸균 0.6 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 첨가하십시오. 총 부피가 25 마이크로 리터인지 확인하십시오. 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도의 열 블록에 1시간 동안 놓습니다.
그런 다음 열 블록에서 튜브를 제거하고 마이크로 피펫을 사용하여 0.84 마이크로 리터의 100 마이크로 몰 팔로이딘을 부드럽게 혼합합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 5-10 분 동안 배양하십시오. conf 초점 이미징을 위한 활성 복합재를 준비하려면 용액에 시약을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
용액을 3 개의 10 마이크로 리터 분취량으로 나누고 K, K 플러스 M 및 음성 대조군으로 표시합니다. K 플러스 M 분취량에 2.54 마이크로리터의 미오신을 첨가하고 K 및 음성 대조군 분취량에 2.54 마이크로리터의 PEM을 첨가한다. 그런 다음 2.5마이크로리터의 Kinesin 클러스터를 K 및 K에 더한 M 분취량과 피펫을 위아래로 추가하여 혼합합니다.
다음으로, 동일한 기술을 사용하여 음성 대조군에 2.5 마이크로 리터의 PEM을 첨가하십시오. 마이크로피펫을 사용하여 모세관 작용을 통해 각 용액을 샘플 챔버의 해당 채널로 천천히 흐르게 합니다. 채널에 기포가 유입되지 않도록 피펫을 매우 천천히 부드럽게 누릅니다.
각 채널의 두 열린 끝을 속건성 에폭시 또는 UV 경화 접착제로 밀봉하십시오. 접착제가 완전히 건조되면 현미경에 채널을 놓아 가능한 한 초기 비활성 상태에 가깝게 합성물을 이미지화합니다. 먼저 K 채널과 K 플러스 M 채널을 이미지화한 다음 제어 채널을 이미지화합니다.
Kinesin 클러스터를 K 및 K에 더한 M 부분 표본에 추가한 후 데이터 수집을 시작할 때까지 경과된 시간을 확인합니다. 액틴을 액틴 또는 AA 가교제로 준비하려면 비오틴-액틴, 뉴트라비딘, 비오틴 및 PEM을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 유사하게, 미세소관에서 미세소관 또는 MM 가교제로의 경우, 비오틴-튜불린, 뉴트라비딘, 비오틴 및 PEM을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
튜브를 열가소성 천장 필름으로 감싸 방수 밀봉을 만들고 90분 동안 섭씨 4도로 설정된 온도 제어 음파 수조의 부양 뗏목에 넣습니다. 이미징을 위해 A-A 가교제 복합체를 샘플에 통합하려면 시약을 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 총 부피가 25 마이크로 리터인지 확인하십시오.
유사하게, M-M 가교제 복합체의 경우, 화면에 표시된 시약을 마이크로 원심분리 튜브에 첨가합니다. 위아래로 피펫팅하여 용액을 혼합하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도의 열 블록에 1시간 동안 놓습니다. 그런 다음 열 블록에서 튜브를 제거하고 마이크로 피펫을 사용하여 0.84 마이크로 리터의 100 마이크로 몰 팔로이딘을 혼합합니다.
빛으로부터 보호되는 실온에서 5-10분 동안 배양하고 앞서 설명한 절차를 반복하여 컨포칼 이미징을 위한 활성 복합재를 준비합니다. 액틴 모노파이버와 튜불린 이량체는 공동 중합되어 액틴 필라멘트와 미세소관의 공동 얽힌 네트워크를 형성합니다. Myosin 두 개의 미니 필라멘트와 Kinesin 클러스터는 필라멘트를 밀고 당겨 복합 재료를 정상 상태에서 벗어나게 합니다.
수동 가교는 NeutrAvidin을 사용하여 비오틴화된 액틴 필라멘트 또는 미세소관을 연결합니다. 미오신 두 개의 미니 필라멘트, 키네신 클러스터 또는 두 모터는 수동 가교, 액틴-액틴 가교결합 및 미세소관-미세소관 가교결합이 없는 복합재에 통합됩니다. 다양한 미오신 농도와 몰 액틴 분획을 가진 미오신 구동 세포 골격 복합체의 두 가지 컬러 컨포칼 이미징이 여기에 표시됩니다.
입자 이미지 속도계는 액틴 미오신 활성이 공동 얽힌 복합체에서 액틴과 미세 소관의 조정 된 수축 역학을 유발한다는 것을 보여줍니다. 여기서 다른 화살표 색상은 벡터 필드의 오른쪽에있는 색상 스케일에 표시된 다른 속도에 해당합니다. 시간 분해 미분 동적 현미경은 시계열의 미세소관 및 액틴 채널에 대해 수행되어 액틴 및 미세소관 모두에 대한 붕괴 시간 대 파수의 특성을 결정합니다.
수축 속도는 각 45분 시계열의 전체 기간 동안 모든 지연 시간에 대해 평균화된 감쇠 시간 곡선에 대한 피팅을 통해 결정됩니다. 시간 분해 미분 동적 현미경은 액틴 및 미세소관의 활성화 시간 45분 동안 연속 6분 간격으로 붕괴 시간을 평가하여 시간에 따른 역학이 어떻게 변하는지를 정량화합니다. 액틴 필라멘트 및 미세소관에 대한 시간 분해 수축 속도는 피팅에서 해당 붕괴 시간 곡선까지 결정됩니다.
공간 이미지 자동 상관 분석은 실험 시작 시 서로 다른 네트워크에 대한 자동 상관 곡선을 종료와 비교하여 활성 세포골격 구성 요소의 모터 구동 구조 조정을 정량화합니다. 자동 상관 곡선의 지수 피팅을 통해 결정된 시간 분해 상관 길이는 실질적으로 재구성되는 복합재에 비해 재구성되지 않는 복합재를 보여줍니다. Kinesin 구동 액틴 미세소관 복합재의 2가지 컬러 컨포칼 이미지는 시간이 지남에 따라 가교제 복합재가 느슨하게 연결된 미세소관이 풍부한 클러스터로 재구성되지 않는 제형 의존적 구조 조정을 보여줍니다.
액틴-액틴 가교는 액틴 미세소관 공동 국소화를 지원하는 반면, 미세소관-미세소관 가교결합은 D 혼합을 향상시킵니다. 미분 동적 현미경 및 공간 이미지 자동 상관 분석은 복합재의 시간에 따라 변하는 역학 및 구조에 대한 가교 및 경쟁 마이신 및 Kinesin 모터의 효과를 보여줍니다. 세포 조건을보다 밀접하게 모방하기 위해 연구자들은 중간 필라멘트, 다른 모터 및 필라멘트 길이와 강성을 제어하는 결합 단백질을 통합 할 수 있습니다.
광학 핀셋 계측 측정을 수행하여 복합 역학을 특성화할 수도 있습니다. 우리의 접근 방식을 사용하여 연구원들은 전례 없는 위상 공간에서 세포 골격에서 영감을 받은 복합 활성 물질의 역학과 구조를 정밀하게 조정하여 다양한 세포 프로세스를 에뮬레이트하고 재구성 가능한 프로그래밍 가능한 재료를 엔지니어링할 수 있습니다.
