इस प्रोटोकॉल ने नीली-एलईडी रोशनी तकनीक का उपयोग करके टीएलसी प्लेट पर यौगिकों की उपज का अनुमान लगाने के लिए एक विधि विकसित की। इस विधि के फायदे यह हैं कि ब्लू-एलईडी रोशनी तकनीक एक सुरक्षित, प्रभावी और सस्ती विधि है, और शोधकर्ता को एक ही समय में कई नमूनों को मापने की अनुमति देती है। इस विधि को जैव रसायन और प्राकृतिक उत्पादों रसायन विज्ञान पर भी लागू किया जा सकता है।
शुरू करने के लिए, 24 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर को सुखाएं। स्टरलाइज़ किए गए चिमटी का उपयोग करके सूखे कल्चर को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और 15 मिलीलीटर एथिल एसीटेट जोड़ें। मिश्रण को एक मिनट के लिए भंवर द्वारा जोर से हिलाएं और ट्यूब को 200 आरपीएम पर हिलाने के साथ 40 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
फिर एक घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर 40 किलोहर्ट्ज अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग करके मिश्रण को सोनिकेट करें। इसके बाद, कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए 5,000 जी पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें और 11 माइक्रोमीटर फिल्टर पेपर के माध्यम से फ़िल्टर करें। एक अलग फ़नल में बाँझ पानी की समान मात्रा के साथ छानना निकालें।
चरण पृथक्करण के बाद, कार्बनिक परत को इकट्ठा करें, इसे रोटरी बाष्पीकरणकर्ता में वाष्पित करें, और अवशेषों को एथिल एसीटेट के दो मिलीलीटर में घोल दें। स्थिर चरण के रूप में सामान्य चरण सिलिका जेल के साथ कॉलम पैक करें, और मोबाइल चरण के रूप में एन-हेक्सेन एथिल एसीटेट और ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड का उपयोग करें। दो मिलीलीटर अर्क को कॉलम पर लोड करें और अर्क को हटाने के लिए एक मिलीलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर मोबाइल चरण विलायक जोड़ें।
लोवास्टेटिन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए टीएलसी द्वारा बहिःस्राव को सत्यापित करने के बाद, 45 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी बाष्पीकरणकर्ता में वाष्पित हो जाता है जब तक कि विलायक को हटा नहीं दिया जाता है। अवशेषों को एथिल एसीटेट के एक मिलीलीटर में घोलें और फिर 1% ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड की समान मात्रा के साथ मिलाएं। कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए 5,000 ग्राम पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें, और एक नई ग्लास ट्यूब में कार्बनिक परत एकत्र करें।
एक केशिका पिपेट का उपयोग करके टीएलसी प्लेट की बेसलाइन पर नमूने और लवस्टैटिन मानकों के पांच माइक्रोलीटर स्पॉट होते हैं, जिससे टीएलसी प्लेट के किनारों पर एक सेंटीमीटर की सीमा छोड़ दी जाती है। फिर कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए टीएलसी प्लेट को फ्यूम हुड में सुखाएं। मोबाइल चरण विलायक युक्त संतृप्त ग्लास कक्ष में बल द्वारा प्लेट को धीरे से रखें।
कक्ष को कांच के ढक्कन से कवर करें और प्लेट को पूरी तरह से विकसित होने दें। जब सॉल्वैंट्स लाइन प्लेट के शीर्ष से एक सेंटीमीटर तक पहुंच जाती है तो प्लेट को कक्ष से हटा दें। एक पेंसिल के साथ विलायक रेखा को चिह्नित करें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फ्यूम हुड में प्लेट को सुखाएं।
सूखने के बाद, तुरंत प्लेट को 10% सल्फ्यूरिक एसिड विलायक में भिगोदें, और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फ्यूम हुड में सुखाएं। इसके बाद, प्लेट को हीटिंग पैनल पर रखें जब तक कि भूरे रंग के धब्बे दिखाई न दें। प्लेट को ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर में स्थानांतरित करें और संगत फ्रीवेयर का उपयोग करके स्कैन करें।
बायोएसे विधि से प्राप्त परिणामों से पता चला कि निषेध क्षेत्र और लवस्टैटिन मानकों के आयामों के बीच आर वर्ग 0.99 था, और प्रतिगमन मॉडल द्वारा भविष्यवाणी के अनुसार नमूना उपज 0.56 मिलीग्राम थी। यूवी डिटेक्शन विधि से पता चलता है कि लोवास्टेटिन मानकों और टीएलसी प्लेट पर बैंड के आयाम के बीच आर वर्ग 0.97 था, और प्रतिगमन मॉडल द्वारा अनुमानित नमूना उपज 0.53 मिलीग्राम थी। हालांकि, बैंड के किनारे धुंधले थे और अपेक्षाकृत कम सिग्नल तीव्रता बैंड देखे गए थे।
ब्लू-एलईडी रोशनी विधि के लिए, टीएलसी प्लेट पर लोवास्टैटिन मानकों और बैंड के आयाम के बीच आर वर्ग 0.98 था, और प्रतिगमन मॉडल द्वारा भविष्यवाणी के अनुसार नमूना उपज 0.54 मिलीग्राम थी। ब्लू-एलईडी इलुमिनेटर का उपयोग करके अनुमानित उपज बायोसेसे विधि के करीब थी और स्पष्ट बैंड प्राप्त किए गए थे। यदि प्लेट को अधिक गर्म किया जाता है, तो लवस्टैटिन का विज़ुअलाइज़ेशन निरीक्षण करना मुश्किल हो सकता है।
