Name: detection of homologous recombination intermediates via proximity ligation and quantitative pcr in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-09-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

يتم دعم العمل في مختبر هاير من خلال المنح GM58015 و GM137751 إلى W.-D.H. يتم دعم البحث في مختبر Piazza من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-StG 3D-loop ، الاتفاقية الكبرى 851006). يتم دعم D.R. من قبل T32CA108459 ومؤسسة AP Giannini. نشكر Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) على مشاركة نتائج فحص DLC / DLE الخاصة به وللتحقق من صحة التغييرات التي تم إجراؤها على المقايسات المفصلة في هذا البروتوكول.

1. ما قبل النمو ، تحريض DSB ، وجمع العينات
ملاحظة: يوصى بمكملات جميع الوسائط التي تحتوي على 0.01٪ أدينين لسلالات Ade.
<ol><li>قم بإخراج السلالات الفردية المناسبة (انظر الجدول 1) على خميرة بيبتون سكر العنب الأدينين (YPDA) (مستخلص الخميرة 1٪ ، 2٪ ببتون ، 2٪ جلوكوز ، 2٪ أجار ?...

<ol>
	<li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).</li><li>Heyer, W. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+recombination+and+genomic+maintenance.">Regulation of recombination and genomic maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).</li><li>Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sae2,+Exo1+and+Sgs1+collaborate+in+DNA+double-strand+break+processing.">Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing.</a> Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).</li><li>Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Holliday+junctions+are+intermediates+of+DNA+break+repair.">Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair.</a> Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).</li><li>Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+coordinates+DNA+end+resection+and+prevents+formation+of+DNA+hairpins.">RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins.</a> Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).</li><li>Maz&#243;n, G., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mph1+and+Mus81-Mms4+prevent+aberrant+processing+of+mitotic+recombination+intermediates.">Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates.</a> Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).</li><li>Saini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+bubble+during+break-induced+replication+drives+conservative+DNA+synthesis.">Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis.</a> Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).</li><li>Piazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+processing+of+displacement+loops+during+recombinational+DNA+repair.">Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair.</a> Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).</li><li>Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proximity+ligation-based+method+for+quantitative+measurement+of+D-loop+extension+in+S.+cerevisiae.">A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).</li><li>Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+roles+of+Rad52,+Rad54,+and+Rad55+proteins+in+Rad51-mediated+recombination.">In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination.</a> Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).</li><li>Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+homology+search+during+DNA+double-strand+break+repair+in+vivo.">Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo.</a> Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).</li><li>Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+of+homologous+DNA+pairing+by+yeast+Rad51+and+Rad54+proteins.">Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins.</a> Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).</li><li>Wright, W. D., Heyer, W. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+functions+as+a+heteroduplex+DNA+pump+modulated+by+its+DNA+substrates+and+Rad51+during+D-loop+formation.">Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation.</a> Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).</li><li>Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -. D., Cam, E. L., Dupaigne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+role+of+Rad54+in+Rad51-ssDNA+filament-dependent+homology+search+and+synaptic+complexes+formation.">In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation.</a> Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).</li><li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination.">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).</li><li>Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+replication+and+telomerase-independent+telomere+maintenance+require+Pol32.">Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32.</a> Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).</li><li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombination+execution+checkpoint+regulates+the+choice+of+homologous+recombination+pathway+during+DNA+double-strand+break+repair.">A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair.</a> Genes &amp; Development. 23 (3), 291-303 (2009).</li><li>Donnianni, R. A., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+replication+occurs+by+conservative+DNA+synthesis.">Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+break-induced+replication+shows+that+it+stalls+at+roadblocks.">Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks.</a> Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).</li><li>Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+kinetics+of+break-induced+replication+(BIR)+by+the+assay+for+monitoring+BIR+elongation+rate+(AMBER).">Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER).</a> Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).</li><li>Pham, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+restraining+break-induced+replication+at+two-ended+DNA+double-strand+breaks.">Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks.</a> The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).</li><li>Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralens+as+photoactive+probes+of+nucleic+acid+structure+and+function:+Organic+chemistry,+photochemistry,+and+biochemistry.">Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry.</a> Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).</li><li>Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkali+reversal+of+psoralen+cross-link+for+the+targeted+delivery+of+psoralen+monoadduct+lesion.">Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion.</a> Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).</li><li>Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-catalyzed+reversal+of+a+psoralen-DNA+cross-link.">Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link.</a> Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Mph1+helicase+dissociates+Rad51-made+D-loops:+Implications+for+crossover+control+in+mitotic+recombination.">Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination.</a> Genes &amp; Development. 23 (1), 67-79 (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Srs2+promotes+synthesis-dependent+strand+annealing+by+disrupting+DNA+polymerase+&#948;-extending+D-loops.">Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase &#948;-extending D-loops.</a> eLife. 6, 22195 (2017).</li><li>Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top3-Rmi1+dissolve+Rad51-mediated+D+loops+by+a+topoisomerase-based+mechanism.">Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism.</a> Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).</li><li>Shah, S. S., Hartono, S. R., Ch&#233;din, F., Heyer, W. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+treatment+and+single-molecule+real-time+sequencing+reveal+D-loop+length,+position,+and+distribution.">Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution.</a> eLife. 9, 59111 (2020).</li></ol>

تسمح المقايسات المقدمة بالكشف عن حلقات D الناشئة والممتدة (مقايسة DLC) ، وتمديد الحلقة D (مقايسة DLE) ، وتشكيل منتج BIR (مقايسة DLE بدون تهجين قليل النيوكليوتيدات) باستخدام ربط القرب و qPCR. تم استخدام ChIP-qPCR ل Rad51 إلى مواقع بعيدة عن DSB سابقا كوكيل للبحث عن التماثل بوساطة Rad51 وتشكيل الحلقة D. ومع ذلك ، فإن...

إعادة التركيب المتماثل (HR) هي آلية عالية الدقة لإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs) ، والوصلات المتقاطعة بين الخيوط ، وفجوات ssDNA ، بالإضافة إلى مسار لتحمل تلف الحمض النووي. يختلف HR عن المسارات المعرضة للخطأ لإصلاح / تحمل تلف الحمض النووي ، مثل الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وتوليف الآفة ، من حيث أنه يستخدم الحمض النووي المزدوج المتماثل السليم كمتبرع لقالب حدث الإصلاح. علاوة على ذلك ، فإن العديد من الوسائط الرئيسية في مسار الموارد البشرية قابلة للعكس ، مما يسمح بتنظيم رائع لخطوات المسار الفردية. خلال المراحل S و G2 و M من دورة الخلية ، تتنافس HR مع NHEJ لإصلاح DSBs1 ذات النهايات. بالإضافة إلى ذلك ، يعد HR ضروريا لتكرار الحمض النووي لإصلاح تلف الحمض النووي المرتبط بالنسخ المتماثل ، بما في ذلك فجوات ssDNA و DSBs أحادية الجانب ، وكآلية لتجاوز آفة الحمض النووي2.
الوسيط الحرج في مسار الموارد البشرية هو حلقة الإزاحة ، أو الحلقة D (الشكل 1). بعد الاستئصال النهائي ، يتم تحميل recombinase المركزي في التفاعل ، Rad51 ، على ssDNA المستقطع حديثا للجزيء المكسور ، مكونا خيطا حلزونيا2. ثم يقوم Rad51 بإجراء بحث تماثلي لتحديد متبرع متماثل مناسب ، عادة ما يكون الكروماتيد الشقيق في الخلايا الجسدية. تتشكل الحلقة D عندما يغزو خيط Rad51-ssDNA الحمض النووي المزدوج المتماثل ، مما يؤدي إلى اقتران قاعدة Watson-Crick للشريط المكسور مع الشريط المكمل للمتبرع ، مما يؤدي إلى إزاحة شريط المتبرع المقابل. يستبدل تمديد الطرف 3 'من الشريط المكسور بواسطة بوليميراز الحمض النووي القواعد التي فقدت أثناء حدث تلف الحمض النووي ويعزز حل وسيط الحلقة D الممتد إلى منتج dsDNA من خلال تلدين الشريط المعتمد على التوليف (SDSA) ، أو تقاطع هوليداي المزدوج (dHJ) ، أو المسارات الفرعية HR للتكرار الناجم عن الكسر (BIR).
تسمح الفحوصات التي تراقب فعليا المواد الوسيطة في مسار الموارد البشرية بتحليل المتطلبات الجينية لكل خطوة (أي تحليل المسار). يتم ملاحظة تكوين DSB ، والاستئصال النهائي ، و dHJs ، وفقاعات تكرار BIR ، ومنتجات الموارد البشرية بسهولة بواسطة النشاف الجنوبي3،4،5،6،7. ومع ذلك ، فشل النشاف الجنوبي في الإبلاغ عن حلقات D الناشئة والممتدة ، وبالتالي ، يلزم وجود طريقة بديلة لقياس جزيئات المفاصل هذه بشكل موثوق4،8،9. إحدى الاستراتيجيات المستخدمة على نطاق واسع لتحليل تكوين الحلقة D الوليدة هي الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ل Rad51 إلى جانب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) 10,11. ومع ذلك ، فإن ارتباط Rad51 مع dsDNA كما تم قياسه بواسطة ChIP-qPCR مستقل عن تماثل التسلسل وعامل ملحق Rad51 Rad5410,11. في المقابل ، تعتمد الإشارة الملموسة باستخدام طريقة تحليل الحلقة D المعروضة هنا ، والتي تسمى مقايسة التقاط الحلقة D (DLC) ، على تكوين DSB ، وتماثل التسلسل ، و Rad51 ، وبروتينات ملحق Rad51 Rad52 و Rad548. إن اكتشاف أن تكوين حلقة D المروج ل Saccharomyces cerevisiae Rad51 يعتمد على Rad54 في الجسم الحي يتفق مع العديد من تجارب إعادة التكوين في المختبر التي تشير إلى أن Rad54 مطلوب للبحث عن التماثل وتشكيل حلقة D بواسطة الخميرة الناشئة Rad518،12،13،14،15.
النهج الحالية لقياس امتداد الحلقة D ، في المقام الأول من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي ، هي إشكالية بالمثل. تعمل المقايسة النموذجية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن امتداد الحلقة D على تضخيم تسلسل فريد ، ناتج عن إعادة التركيب بين موقع الكسر والمتبرع خارج الرحم وتخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب اللاحق ، عبر تمهيدي في المنبع لمنطقة التماثل على الشريط المكسور والتمهيدي الآخر في اتجاه مجرى منطقة التماثل على الشريط المانح. باستخدام هذه الطريقة ، يتطلب الكشف عن تخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب عامل معالجة Pol δ غير الأساسي Pol3216. تتعارض هذه النتيجة مع ملاحظة أن حذف POL32 له تأثير خفيف فقط على تحويل الجينات في الجسم الحي17. علاوة على ذلك ، تفشل هذه المقايسات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في حل امتداد الحلقة D وتشكيل منتج BIR مؤقتا ، مما يشير إلى أن الإشارة تنتج عن منتجات dsDNA بدلا من وسيطة ssDNA17،18،19. تم تطوير مقايسة تمديد الحلقة D (DLE) مؤخرا لمعالجة هذه التناقضات. يحدد اختبار DLE تخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب في موقع ~ 400 زوج أساسي (bp) في اتجاه مجرى النهر من النهاية الغازية الأولية3 '9. بهذه الطريقة ، يكون امتداد الحلقة D مستقلا عن Pol32 ويمكن اكتشافه في غضون 4 ساعات بعد تحريض DSB ، بينما يتم ملاحظة منتجات BIR لأول مرة في 6 ساعات. في الواقع ، أشار منشور حديث من مختبرات هابر ومالكوفا إلى أن استخدام هذه الطريقة في تحضير الحمض النووي الجينومي يؤدي بشكل فريد إلى الحفاظ على ssDNA 9,20.
هنا ، يتم وصف مقايسات DLC و DLE بالتفصيل. تعتمد هذه المقايسات على ربط القرب للكشف عن حلقات D الناشئة والممتدة في S. cerevisiae (الشكل 2) 8,9. يمكن قياس كمية منتجات BIR باستخدام نفس نظام المقايسة. بالنسبة لكلا الفحصين ، يتم تحفيز تكوين DSB في موقع قطع نوكلياز HO الموجود في موضع URA3 على الكروموسوم (Chr.) V من خلال التعبير عن نوكلياز HO تحت سيطرة مروج محفز للجالاكتوز. يؤدي غزو حبلا الحمض النووي بوساطة Rad51 إلى تكوين حلقة D ناشئة في موقع متبرع خارج الرحم يقع في موضع LYS2 في Chr. II. نظرا لأن الجانب الأيمن من DSB يفتقر إلى التماثل مع المتبرع ، فإن الإصلاح عبر SDSA وتشكيل dHJ غير ممكن. من الممكن إجراء إصلاح أولي لجهاز DSB بواسطة BIR ، ولكن يتم تثبيط تكوين منتجات قابلة للحياة من خلال وجود centromere21. يمنع هذا التصميم المتعمد إصلاح DSB الإنتاجي ، وبالتالي تجنب استئناف النمو بواسطة الخلايا ذات DBSs التي تم إصلاحها ، والتي يمكن أن تتجاوز الثقافة أثناء تحليل الدورة الزمنية.
في مقايسة DLC ، يحافظ تشابك السورالين لشريطي الحمض النووي غير المتجانس داخل الحلقة D على وسيط إعادة التركيب. بعد استعادة موقع إنزيم التقييد على الشريط المكسور (المستأصل) والهضم ، يسمح التشابك بربط التسلسلات الفريدة في المنبع للحمض النووي المتماثل المكسور والمتبرع. باستخدام qPCR ، يتم تحديد مستوى جزيء الحمض النووي الخيمري الموجود في كل عينة. في فحص DLE ، لا يلزم التشابك ، واستعادة موقع إنزيم التقييد والهضم متبوعا بالربط داخل الجزيئات بدلا من ذلك يربط نهاية 5 'من الجزيء المكسور بنهاية 3' الممتدة حديثا. مرة أخرى ، يتم استخدام qPCR لتحديد الكميات النسبية لهذا المنتج الوهمي في كل عينة. في حالة عدم استعادة موقع إنزيم التقييد ، يبلغ اختبار DLE عن المستويات النسبية لمنتج BIR (dsDNA) الذي يتم تشكيله بعد تمديد الحلقة D.
يتم عرض النتائج التمثيلية لكل اختبار باستخدام سلالة من النوع البري ، ويتم إحالة القراء إلى Piazza et al.8 و Piazza et al.9 لاستخدام هذه المقايسات لتحليل طفرات إعادة التركيب 8,9. الغرض من هذه المساهمة هو تمكين المختبرات الأخرى من اعتماد مقايسات DLC و DLE ، والدعم متاح عند الطلب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 and 50 mL conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL glass culture tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL, 500 mL, or 1 L flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60% w/w sodium DL-lactate syrup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1375</td>
			<td>For media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>For media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211840</td>
			<td>For media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>212750</td>
			<td>For media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>0155-17-4</td>
			<td>For media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trioxsalen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6137</td>
			<td>For psoralen cross-linking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen or dry ice/ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>For spheroplasting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101</td>
			<td>Restriction enzyme digest for DLC assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3104</td>
			<td>Restriction enzyme digest for DLE assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Intramolecular ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. DNA purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2069</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Psoralen cross-link reversal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler/PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>qPCR machine used by the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>qPCR machine used by the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 96-Well Plate, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725271</td>
			<td>qPCR kit used by the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td>qPCR kit used by the authors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of homologous recombination intermediates via proximity ligation and quantitative pcr in saccharomyces cerevisiae

يمكن إصلاح تلف الحمض النووي ، بما في ذلك فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والوصلات المتقاطعة بين الخيوط ، والتي تحدث خلال مرحلتي S و G2 من دورة الخلية عن طريق إعادة التركيب المتماثل (HR). بالإضافة إلى ذلك ، تمثل الموارد البشرية آلية مهمة لإنقاذ شوكة النسخ المتماثل بعد التوقف أو الانهيار. إن تنظيم العديد من الخطوات القابلة للعكس والتي لا رجعة فيها لهذا المسار المعقد يعزز إخلاصه. يتيح التحليل الفيزيائي لوسيطات إعادة التركيب التي تشكلت أثناء الموارد البشرية توصيف هذه الضوابط بواسطة عوامل البروتين النووي المختلفة وتفاعلاتها. على الرغم من وجود طرق راسخة لفحص أحداث ووسيطات محددة في مسار إعادة التركيب ، إلا أن اكتشاف تكوين الحلقة D وتمديدها ، وهما خطوتان حاسمتان في هذا المسار ، أثبت أنه يمثل تحديا حتى وقت قريب. هنا ، يتم وصف طرق فعالة للكشف عن الأحداث الرئيسية في مسار الموارد البشرية ، وهي تشكيل كسر الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل ، وتشكيل الحلقة D ، وتمديد الحلقة D ، وتشكيل المنتجات عن طريق النسخ المتماثل الناجم عن الكسر (BIR) في Saccharomyces cerevisiae . تكتشف هذه المقايسات وسيطة إعادة التركيب ذات الصلة والمنتجات ذات الحساسية العالية ومستقلة عن الجدوى الخلوية. يعتمد اكتشاف الحلقات D وامتداد الحلقة D ومنتج BIR على ربط القرب. تسمح هذه المقايسات معا بدراسة حركية الموارد البشرية على مستوى السكان لمعالجة وظائف بروتينات الموارد البشرية والمنظمين بدقة في خطوات مهمة في المسار.

مقايسة DLC يكتشف اختبار DLC كلا من حلقات D الناشئة والموسعة التي تشكلت من خلال غزو DSB خاص بالموقع إلى متبرع واحد (الشكل 2). يربط تشابك Psoralen جسديا الشريط المكسور والمتبرع عبر الحمض النووي غير المتجانس داخل الحلقة D. تسمح استعادة موقع إنزيم التقييد باستخدام oligo طويل...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

تستخدم مقايسات التقاط الحلقة D (DLC) وامتداد الحلقة D (DLE) مبدأ ربط القرب مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتحديد تكوين الحلقة D وتمديد الحلقة D وتشكيل المنتج في موقع كسر مزدوج تقطعت به السبل في Saccharomyces cerevisiae.

الكشف عن وسيطة إعادة التركيب المتماثلة عن طريق ربط القرب و PCR الكمي في Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

تعد فحوصات التقاط وتمديد الحلقة D هي الأولى التي تسمح بالقياس الكمي غير المتحيز والمباشر لتشكيل الحلقة D وخطوات التمديد أثناء إعادة التركيب المتماثل في خلايا الخميرة التي تنمو بشكل انقسامي. تسمح هذه التقنية المستقلة عن الجدوى بدراسة البروتينات في استقلاب D-loop التي لن يكون من الممكن فصلها عن الأدوار اللاحقة ، بمجرد النظر إلى منتجات BIR. في المستقبل ، نتصور نقل هذه المقايسات إلى خلايا بشرية لفهم دور البروتينات الرئيسية بشكل أفضل ، بما في ذلك BRCA2 وحالات بلوم ووارنر كيلو في إعادة التركيب المتماثل.ابدأ بالطرد المركزي للعينات لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 2.5 ملليلتر من محلول 1x psoralen وانقلها إلى طبق بتري 60 × 15 ملم. لعدم وجود عنصر تحكم في الربط المتشابك، أعد تعليق الحبيبات في 2.5 ملليلتر من محلول TE1.بعد ذلك ، اضبط مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية في الجزء العلوي في شاكر مداري ، تم ضبطه على 50 دورة في الدقيقة. لربط العينات باستخدام رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية مع لمبات موجة طويلة 365 نانومتر. ضع أطباق بتري على بعد سنتيمتر إلى سنتيمترين تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق مع رجها برفق على طبق بلاستيكي أو زجاج شبكي مبرد مسبقا.ثم نقل العينة إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. اشطف طبق بتري ب 2.5 ملليلتر من محلول TE1 وأضفه إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة خمس دقائق.تخلص من المادة الطافية وقم بتخزين الحبيبات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. ضع العينات على الثلج للذوبان. في وقت واحد ، سخن حمام جاف إلى 30 درجة مئوية.أعد تعليق العينات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للسفع الكروي وانقلها إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 3.5 ميكرولتر من محلول zymolyase واخلطه بلطف عن طريق النقر. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.ثم ضع الأنابيب على الجليد. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق ووضع العينات على الجليد. اغسل العينات ثلاث مرات في محلول تفجير كروي واحد ملليلتر وجهاز طرد مركزي للعينات لمدة ثلاث دقائق.أعد تعليق العينات في ملليلتر واحد من محلول إنزيم تقييد البارد. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق ووضع العينات على الجليد. كرر الغسيل مرة واحدة.أعد تعليق العينات في ملليلتر واحد من محلول إنزيم تقييد بارد 1x. قسم العينة بالتساوي إلى قسمين. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة ثلاث دقائق عند 16،000 G عند أربع درجات مئوية.أعد تعليق أنبوب واحد من كل عينة في 180 ميكرولتر من محلول إنزيم التقييد 1.4x مع تهجين oligos وأنبوب آخر في 180 ميكرولتر من محلول إنزيم التقييد 1.4x دون تهجين oligos. التقط تجميد العينات في النيتروجين السائل. قم بإذابة العينات على الجليد.سخن حماما جافا إلى 65 والآخر إلى 37 درجة مئوية. حصة 36 ميكرولتر من العينة في أنبوب طرد مركزي صغير جديد وأربعة ميكرولتر من 1٪ SDS وتخلط عن طريق النقر برفق على جانب الأنبوب. احتضن عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع النقر اللطيف كل خمس دقائق.ضع العينات على الثلج مباشرة بعد الحضانة. أضف 4.5 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 واخلطها عن طريق السحب. أضف 20 إلى 50 وحدة من إنزيم تقييد EcoR1 أو HindIII عالي الدقة إلى كل عينة.واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع التقليب اللطيف كل 20 إلى 30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، حمام جاف مسخن إلى 55 درجة مئوية وحمام مائي إلى 16 درجة مئوية. أضف 8.6 ميكرولتر من 10٪ SDS إلى كل عينة واخلطها عن طريق السحب والتنصت.احتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 80 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 إلى كل عينة واخلطها عن طريق السحب. أضف 660 ميكرولترا من 1x مخزن ربط مؤقت بدون ATP ، و ATP واحد مليمولار عند الرقم الهيدروجيني 8.0 وثماني وحدات من T4 DNA ligase لكل عينة ، واخلطها برفق عن طريق الانقلاب.احتضان 16 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة مع انعكاس كل 30 دقيقة. ضع العينات على الثلج مباشرة بعد الحضانة. بعد تنقية الحمض النووي كما هو موضح في البروتوكول ، استخدم ميكرولترين من الحمض النووي المنقى لإعداد تفاعل qPCR سعة 20 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.لكل عينة ، قم بإعداد خمسة تفاعلات تحكم وتفاعل قياس كمي واحد وقم بتشغيلها في نسختين. أظهر تحليل مقايسة DLC بعد ساعتين من كسر مزدوج تقطعت بهم السبل أو تحريض DSB أن الربط المتقاطع للسورالين أمر بالغ الأهمية وأن الكفاءة تعتمد على الوقت بين جمع العينات و qPCR. كانت قيم ARG4 Cp متشابهة بين العينات المتشابكة ولكنها أقل بالنسبة للعينة التي لا تحتوي على روابط متقاطعة لأن الحمض النووي بدون روابط متقاطعة يتضخم بشكل أكثر كفاءة.بالنسبة لجميع العينات ، كان التحكم في qPCR للربط بين الجزيئات ضمن النطاق. تم إثبات تحريض DSB القوي من خلال إشارة qPCR منخفضة للتحكم الذي يتضخم عبر موقع التعرف على نوكلياز HO endonuclease. لوحظت نتائج مماثلة للتحكم في EcoR1 qPCR.تم حساب إشارة DLC مع تهجين oligo عن طريق التطبيع إلى التحكم في الربط بين الجزيئات. أظهر تحليل مقايسة DLE الذي تم إجراؤه بعد ست ساعات من تحريض DSB أن قيم ARG4 CP كانت متشابهة بين عينة oligos المهرجة وبدونها. كشف التحكم qPCR في الربط بين الجزيئات عن إشارة مقبولة لعينة oligos مع وبدون تهجين ولكن إشارة أقل للعينة الفاشلة.في جميع العينات الثلاث ، كان هناك تحريض قوي ل DSB. نظرا لأن انشقاق HindIII يعتمد على استعادة موقع إنزيم التقييد بواسطة oligo المهجن. كان هناك اختلاف كبير في التضخيم عبر موقع انشقاق HindIII على الشريط المقطوع بين العرض وبدون عينات oligo.لوحظ اختلاف أصغر في التضخيم عبر الموقع على الشريط الممتد لأن الانقسام HindIII هنا يعتمد أيضا على الامتداد. يجب أن تبقى العينات والمخزن المؤقت باردة في جميع الأوقات. يجب تجميد العينات تلقائيا بعد إعادة التعليق في محلول إنزيم تقييد بارد 1.4x مع أو بدون تهجين oligos.يمكن دراسة التأثيرات النهائية لتشكيل الحلقة D وتمديدها على تكوين المنتج باستخدام النشاف الجنوبي أو مقايسات نقطة النهاية الجينية. يمكن التحقيق في التأثيرات على البحث التماثلي باستخدام CP العالي. يمكن أن يوفر الترسيب المناعي للكروماتين معلومات حول تجنيد بروتين مهم.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

دمج المطلق والنسبي البيانات الكمية PCR لتحديد STAT3 لصق النصوص البديل

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في<em&gt; ساكاروميسز سيريفيسياي</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

رسم الخرائط الوراثية للاختلافات التسامح الحراري بين أنواع الخميرة Saccharomyces عن طريق تحليل الهيميزيغوستي على نطاق الجينوم المتبادل

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية النوع 1 (HIV-1) البروتين انتيسنس (ASP) الحمض الريبي النيبالي المستنسخات في المرضي التي كتبها RT-PCR الخاصة

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...