Name: atac-seq optimization for cancer epigenetics research
Uploaded: 2022-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research at JoVE.com

UND 유전체학 핵심 시설에 탁월한 기술 지원에 감사드립니다.
이 연구는 국립 보건원 [P20GM104360에서 M.T., P20 GM104360에서 A.D.]과 노스 다코타 대학교 의과 대학 및 건강 과학 대학 생물 의학과에서 제공 한 창업 기금에서 자금을 지원했습니다.

1. 실험 시작 전 준비
<ol><li>용해 완충액을 준비하십시오. 참고: 최적의 핵 분리 버퍼는 각 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 트리판 블루 염색을 사용하여 각 세포 유형에 대해 원본 논문8에 사용된 저장성 완충액과 CSK 완충액12,13을 모두 테스트하는 것이 좋습니다.<ol><li>저장성 완충액(그린리프 완충액)을 제조하기 ?...

<ol>
	<li>Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+the+regulatory+epigenome.">Chromatin accessibility and the regulatory epigenome.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+chromatin+accessibility+in+human+cancers.">Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers.</a> Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).</li><li>Sanghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+associates+with+protein-RNA+correlation+in+human+cancer.">Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer.</a> Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+accessibility+landscape+of+primary+human+cancers.">The chromatin accessibility landscape of primary human cancers.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Boyle, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+and+characterization+of+open+chromatin+across+the+genome.">High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome.</a> Cell. 132 (2), 311-322 (2008).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+DNA+methylation+and+chromatin+structural+analysis+at+single-molecule+resolution.">Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution.</a> Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).</li><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+chromatin+defined+by+DNaseI+and+FAIRE+identifies+regulatory+elements+that+shape+cell-type+identity.">Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity.</a> Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).</li><li>Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+overview+of+epigenomic+profiling+methods.">A comparative overview of epigenomic profiling methods.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).</li><li>Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+quality+ATAC-Seq+data+recovered+from+cryopreserved+breast+cell+lines+and+tissue.">High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue.</a> Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).</li><li>Takaku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3-dependent+cellular+reprogramming+requires+activation-domain+dependent+recruitment+of+a+chromatin+remodeler.">GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler.</a> Genome Biology. 17, 36 (2016).</li><li>Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).</li><li>. Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: <a target="_blank" href="https://broadinstitute.github.io/picard/">https://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2022)</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INO80+governs+superenhancer-mediated+oncogenic+transcription+and+tumor+growth+in+melanoma.">INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).</li><li>Takaku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA3+zinc+finger+2+mutations+reprogram+the+breast+cancer+transcriptional+network.">GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network.</a> Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).</li><li>Oldfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Y+controls+fidelity+of+transcription+initiation+at+gene+promoters+through+maintenance+of+the+nucleosome-depleted+region.">NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region.</a> Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).</li><li>Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+SMARCB1+suppresses+super-enhancers+to+govern+hESC+lineage+determination.">Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination.</a> Elife. 8, 45672 (2019).</li><li>Elrod, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrator+complex+attenuates+promoter-proximal+transcription+at+protein-coding+genes.">The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes.</a> Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Porter, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+inhibition+with+specific+activation:+How+p53+and+MYC+redistribute+the+transcriptome+in+the+DNA+double-strand+break+response.">Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response.</a> Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).</li><li>Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+mediates+epithelial+to+mesenchymal+transitions+by+repression+of+estrogen+receptor-alpha.">The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha.</a> Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).</li><li>McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PeaKDEck:+A+kernel+density+estimator-based+peak+calling+program+for+DNaseI-seq+data.">PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).</li><li>Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+profiling+by+ATAC-seq.">Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+breast+cancer+therapy+and+resistance.">Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).</li><li>Bhattacharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium+channel+proteins+ORAI3+and+STIM1+mediate+TGF-&#946;+induced+Snai1+expression.">The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-&#946; induced Snai1 expression.</a> Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).</li><li>Schep, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+nucleosome+fingerprints+enable+high-resolution+mapping+of+chromatin+architecture+within+regulatory+regions.">Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions.</a> Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).</li></ol>

ATAC-seq는 개방 및 활성 염색질 영역을 매핑하는 데 널리 사용되었습니다. 암세포 진행은 종종 유전적 변형과 후성유전학적 재프로그래밍에 의해 주도되어 염색질 접근성과 유전자 발현이 변경됩니다. 이러한 재프로그래밍의 예는 상피-중간엽 전이(EMT) 및 이의 역과정인 중간엽-상피로의 전이(MET) 동안 볼 수 있으며, 이는 종양 전이 동안 주요 세포 재프로그래밍 과정으로 알려져 있다(<sup class="xref"...

염색질 접근성은 게놈전체 규모에서 유전자 발현을 조절하기 위한 핵심 요구 사항입니다1. 염색질 접근성의 변화는 종종 암 2,3,4를 포함한 여러 질병 상태와 관련이 있습니다. 수년에 걸쳐 연구자들이 염색질 접근성 영역을 매핑하여 염색질 환경을 조사할 수 있도록 수많은 기술이 개발되었습니다. 그 중 일부에는 DNase-seq(DNase I 과민성 부위 시퀀싱)5, FAIRE-seq(조절 요소의 포름알데히드 보조 분리)6, MAPit(개별 템플릿에 대한 메틸트랜스퍼라제 접근성 프로토콜)7 및 이 논문의 초점인 ATAC-seq(전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 분석)8이 포함됩니다. DNase-seq는 DNase의 주요 특징, 즉 히스톤 및 전사 인자5와 같은 기타 단백질이 없는 네이키드 DNA의 우선적 소화를 사용하여 접근 가능한 영역을 매핑합니다. CHIP-seq와 유사한 FAIRE-seq는 면역 침전이 관여하지 않는 것을 제외하고는 포름 알데히드 가교 및 초음파 처리를 사용하며 뉴 클레오 솜이없는 영역은 페놀-클로로포름 추출6에 의해 분리됩니다. MAPit 방법은 GC 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 단일 분자 분해능7에서 염색질 구조를 프로브합니다. ATAC-seq는 과민성 전이 효소 Tn58에 의존합니다. Tn5 트랜스포아제는 개방 염색질 영역에 우선적으로 결합하고 시퀀싱 어댑터를 접근 가능한 영역에 삽입합니다. Tn5는 DNA-매개 "잘라내기 및 붙여넣기" 메커니즘을 통해 작동하며, 이에 의해 어댑터가 미리 로드된 트랜스포아제는 염색질 부위를 개방하고, DNA를 절단하고, 어댑터(8)를 결찰한다. Tn5 결합 영역은 이들 어댑터에 어닐링하는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 회수된다. FAIRE-seq 및 DNase-seq는 시퀀싱 전에 많은 양의 출발 물질(~100,000 세포 내지 225,000 세포)과 별도의 라이브러리 준비 단계를 필요로 합니다9. 반면에 ATAC-seq 프로토콜은 비교적 간단하며 적은 수의 셀(<50,000개 셀)10이 필요합니다. FAIRE-seq 및 DNase-seq 기술과 달리 ATAC-seq의 시퀀싱 라이브러리 준비는 분리된 DNA 샘플이 이미 Tn5에 의해 시퀀싱 어댑터로 태그되고 있기 때문에 비교적 쉽습니다. 따라서, 라이브러리 준비를 완료하기 위해 적절한 프라이머를 사용한 PCR 증폭 단계만이 필요하며, 최종 수리 및 어댑터 라이게이션과 같은 사전 처리 단계가 수행될 필요가 없으므로, 시간(11)을 절약할 수 있다. 둘째, ATAC-seq는 MAPit7에 필요한 영역 특이적 프라이머를 사용한 중아황산염 전환, 클로닝 및 증폭의 필요성을 방지합니다. 이러한 장점으로 인해 ATAC-seq는 개방 염색질 영역을 정의하는 데 매우 인기 있는 방법이 되었습니다. ATAC-seq 방법은 간단하지만 고품질의 재현 가능한 데이터를 얻기 위해 여러 단계를 최적화해야 합니다. 이 원고는 표준 ATAC-seq 라이브러리 준비에 대한 최적화 절차에 대해 논의하며, 특히 (1) 용해 완충액 조성, (2) Tn5 트랜스포아제 농도 및 (3) 세포 수의 세 가지 매개변수를 강조합니다. 또한, 이 논문은 암성 및 비암성 부착성 상피 세포를 모두 사용한 최적화 조건의 예제 데이터를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L XL TipOne tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-3810</td>
			<td>Filtered and low-retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L XL TipOne RPT tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1182-1830</td>
			<td>Filtered and low-retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L XL TipOne tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1840</td>
			<td>Filtered and low-retention. Beveled Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TipOne RPT tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1183-1810</td>
			<td>Filtered and low-retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L TipOne RPT tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-8810</td>
			<td>Filtered and low-retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>YBP136010</td>
			<td>Genetic Analysis Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All the cell lines used in this study are obtained from ATCC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-30R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>364658</td>
			<td>SX2415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Bead purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop Cell Counter</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>CellDrop FL</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td>BioUltra, anhydrous, &#8805;99% (titration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615100020</td>
			<td>Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - TET Tested</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S10350</td>
			<td>Triple 0.1 &#181;m filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM 1x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS 1x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Trypsin-EDTA 1x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>(0.25%), phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>BioXtra, &#8805;98% (acidimetric), pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-1030</td>
			<td>2x TD and Tn5 Transposase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP - 40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855484</td>
			<td>CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td>BioPerformance Certified, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quibit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>-</td>
			<td>pH 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix, 1.25 mL</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4700</td>
			<td>Flex-free, natural, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate 384-WELL PCR PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1438-4700</td>
			<td>Single notch. Natural polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>648311</td>
			<td>ULTROL Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>PE-121-1003</td>
			<td>paired-end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>BioXtra, viscous liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td>sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq optimization for cancer epigenetics research

고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 분석은 과민성 Tn5 트랜스포아제를 사용하여 디옥시리보 핵산(DNA) 접근성을 프로브합니다. Tn5는 접근 가능한 염색질 영역 내에서 고처리량 시퀀싱을 위해 어댑터를 절단하고 연결합니다. 진핵 세포에서 게놈 DNA는 DNA, 히스톤 및 기타 단백질의 복합체인 염색질로 포장되어 전사 기계에 대한 물리적 장벽 역할을 합니다. 외적 신호에 반응하여, 전사 인자는 유전자 활성화를 위한 전사 기계에 접근할 수 있도록 염색질 리모델링 복합체를 모집합니다. 따라서, 개방된 염색질 영역을 확인하는 것은 암 진행과 같은 생물학적 사건 동안 인핸서 및 유전자 프로모터 활성을 모니터링할 때 유용하다. 이 프로토콜은 사용하기 쉽고 세포 입력 요구 사항이 낮기 때문에 ATAC-seq는 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 열린 염색질 영역을 정의하는 데 널리 채택되었습니다. 성공적인 데이터 수집을 위해서는 ATAC-seq 라이브러리를 준비할 때 몇 가지 파라미터를 고려해야 합니다. 그 중 세포 용해 완충액의 선택, Tn5 효소의 적정 및 세포의 시작 부피는 암세포에서 ATAC-seq 라이브러리 준비에 중요합니다. 최적화는 고품질 데이터를 생성하는 데 필수적입니다. 여기에서는 상피 세포 유형에 대한 ATAC-seq 최적화 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

성공적이고 고품질의 ATAC-seq 데이터를 얻으려면 실험 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. ATAC-seq 라이브러리 준비는 세포 용해, 태그먼트(Tn5에 의한 단편화 및 어댑터 삽입), 게놈 DNA 정제, PCR 증폭 및 데이터 분석의 5가지 주요 단계(그림 1)로 분리할 수 있습니다. 초기 과정으로, 세포 용해 (핵 분리) 완충액은 먼저 각 세포 유형에 대해 최적화되어야합니다. 원래의 ATAC-seq 논?...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research at JoVE.com

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.

암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

ATAC-seq를 사용하면 게놈에서 열린 염색질 영역의 상태를 식별 할 수 있으며, 이는 정상 상태와 비교하여 질병 상태에서 종종 변경됩니다. 더 적은 세포 입력, 단순화된 Tn5 분해 프로토콜, 단편화된 DNA의 분리 및 PCR 증폭에 의한 라이브러리 준비 및 더 짧은 실험 시간은 더 유리한 기술입니다. 정상 상태와 질병 상태 사이의 ATAC-seq에 의한 변화된 후성유전학적 환경의 비교는 질병 관련 염색질 조절 요소를 밝히고 새로운 치료 전략을 설계하는 데 유용할 수 있습니다.이 기술은 중요한 실험 단계를 포함하지 않으므로 수행하기 쉽습니다. 성공적인 ATAC-seq 결과를 얻으려면 몇 가지 표준화 단계만 거치면 됩니다. 시작하려면 PBS에 밀리리터당 백만 개의 세포를 포함하는 세포 현탁액에서 25마이크로리터를 1.7밀리리터 미세원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다.상청액을 조심스럽게 버리고 25 마이크로 리터의 용해 완충액을 첨가하십시오. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 다시 부유시키고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 5 분 동안 500G에서 원심 분리하고 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.펠렛을 25 마이크로리터의 Tn5 반응 혼합물에 즉시 재현탁시키고, 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 용액을 혼합하십시오. 5 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨과 125 마이크로 리터의 완충액 PB를 Tn5 태그 DNA 용액에 첨가하십시오.잘 섞는다. 다음으로, 스핀 컬럼을 2밀리리터 수집 튜브에 넣고 샘플을 스핀 컬럼에 적용합니다. 실온에서 1분 동안 17, 900 g에서 원심분리하고, 유동을 폐기한다.PE 버퍼를 열에 추가하고 열을 회전합니다. 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣고 5분 동안 원심분리하여 멤브레인을 완전히 건조시킵니다. 플로우 스루를 폐기하고 스핀 컬럼을 새 1.7밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.DNA 단편을 10 마이크로리터의 완충액 EB로 용리시키고, 컬럼을 실온에서 1분 동안 방치한다. 그 후 17, 900 G에서 실온에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용출시켰다. 200마이크로리터 PCR 튜브에서 PCR 반응을 설정하고 PCR 증폭 프로그램 파트 1을 수행합니다.실시간 QPCR의 경우, 5마이크로리터의 PCR 산물, 0.75마이크로리터의 1, 000배 희석된 SYBR 골드, 5마이크로리터의 2X PCR 마스터 믹스 및 3.75마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물을 첨가하여 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 실행 파라미터를 사용하여 필요한 추가 PCR 주기 수를 결정합니다. 주기 번호가 결정되면 이전에 계산된 추가 주기로 PCR을 설정합니다.증폭된 PCR 산물에, 150 마이크로리터의 비드를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 5 분 동안 놓고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 비드를 200 마이크로리터의 80% 에탄올로 세척하고, 상청액을 제거한다.에탄올을 완전히 제거하고 샘플을 실온에서 10분 동안 자연 건조시킨다. 마지막으로, 50 마이크로리터의 용출 완충액으로 재현탁시킨다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓은 다음 용출액을 새로운 1.7ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.트리판 블루를 사용한 세포 용해 효율의 비교가 여기에 나와 있습니다. NMuMG 세포를 저장성 완충액 및 CSK 완충액으로 처리하고 트리판 블루로 염색하였다. CSK 처리된 세포에서 더 높은 세포 용해 효율이 관찰되었습니다.ATAC-seq 라이브러리는 MDA-MB-231 유방암 세포로부터 제조하였다. PCR 증폭 후, PCR 산물을 비드 정제 전후의 0.5X TBE, 1.5% 아가로스 겔에서 분석하였다. 프라이머는 대부분 초기 비드 정제에 의해 제거된다.1X TAE 1%아가로스 겔 전기영동 및 자동 전기영동으로부터의 DNA 밴드 패턴도 표시됩니다. SYBR 골드는 여기에 표시된 DNA 단편을 시각화하는 데 사용되었습니다. ERS1 유전자좌를 보여주는 게놈 브라우저 트랙이 여기에 표시됩니다.T47D 세포에서 ATAC-seq 데이터의 게놈 커버리지가 이 이미지에 나와 있습니다. 이전 간행물의 프라이머가 사용되었으며 표적 영역은 노란색으로 강조 표시됩니다. ATAC-seq 라이브러리에서 프라이머 앰플리콘 농축을 나타내는 막대 그래프가 여기에 나와 있습니다.ATAC-seq 라이브러리는 저장성 완충액 또는 CSK 완충액에 의해 제조하였다. 대표 이미지는 ATAC-seq 최적화를 위한 게놈 브라우저 시각화를 보여줍니다. 25, 000 세포 입력 조건의 ATAC-seq 데이터는 뉴 클레오 솜이없는 단편의 가장 높은 농축을 나타 냈으며, 100, 000 세포 입력 조건은 가장 높은 단핵 DNA를 나타 냈습니다.다른 세포 번호의 ATAC-seq 데이터를 보여주는 게놈 브라우저 트랙이 여기에 표시됩니다. HOMER 피크 주석 분석은 이 대표 이미지에 묘사되어 있습니다. HOMER은 각 피크를 프로모터 근위 또는 원위 피크로 분류했습니다.세포 용해 완충액의 세포 입력 선택 횟수와 세포 유형에 의존하는 Tn5 효소의 농도는 표준화되어야 하는 가장 중요한 매개변수입니다. 절단 및 압정 기술에서 단백질 A와 융합된 Tn5는 관심 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 관심 단백질의 DNA 결합 부위를 식별하는 데 널리 사용됩니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Vestibular Schwannoma 연구를위한 통합 방법론 체계

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

연구

암 연구학

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq를 위한 신선한 냉동 뇌 종양에서 핵 절연

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

췌장암의 정형소 절제술 마우스 모델

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

순환 종양 세포 주: 근본적이고 번역적인 연구를 위한 혁신적인 도구

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Non-Radioactive Chemiluminescence Detection을 사용한 텔로미어 길이 정량화

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

저자 스포트라이트: TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 파라미터 최적화  

TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 매개변수 최적화

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...