Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

يود المؤلفون إظهار امتنانهم واحترامهم لجميع الحيوانات التي تساهم بخلاياها في هذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0111200 ، Yi Liao و Yuan Gao و Grant nos. 2018YFA0107301 ، Wei Li). يشكر المؤلفون Jingru Huang و Xiang You من المختبر المركزي ، كلية الطب ، جامعة شيامن على الدعم الفني في التصوير البؤري.

امتثل استخدام التجارب للوائح جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات إدارة التجارب بجامعة شيامن.
1. تحضير الأجهزة الجراحية التجريبية ، وإنزيم هضم الأنسجة ، ومخزن زراعة الخلايا
<ol><li>قم بإعداد الأجهزة الجراحية التجريبية ، عن طريق ت...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

هنا ، تم وصف بروتوكول مفصل ومحسن لعزل وثقافة وتوصيف خلايا RPE من مقل عيون الخنازير ، والذي يولد نموذجا جيدا للتوصيف المختبري لخلايا RPE ودراسات الاضطرابات المتعلقة ب RPE. تم وصف طرق عزل RPE عن عيون الإنسان والفأر والفئران سابقا23،24،25. ومع ذ?...

تقع ظهارة صبغة الشبكية (RPE) بين المستقبلات الضوئية والمشيمية الشعرية في الطبقة الخارجية من الشبكية1 مع وظائف متعددة ، بما في ذلك تشكيل حاجز الدم والشبكية ، ونقل وتبادل العناصر الغذائية ومستقلبات الشبكية ، وإعادة تدوير فيتامين أ للحفاظ على دورة بصرية طبيعية ، والبلعمة وإزالة الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية (POSs)2,3 . نظرا لأن نقاط البيع تتطلب تجديدا ذاتيا مستمرا لتوليد الرؤية ، فإن خلايا RPE تحتاج إلى ابتلاع نقاط البيع المنفصلة باستمرار للحفاظ على توازن الشبكية4. لذلك ، يؤدي الخلل الوظيفي في RPE إلى العديد من أمراض العيون المسببة للعمى ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)4 ، التهاب الشبكية الصباغي (RP)5 ، داء ليبر الخلقي6 ، اعتلال الشبكية السكري7 ، إلخ. حتى الآن ، لا يزال التسبب الدقيق لمعظم هذه الأمراض بعيد المنال. نتيجة لذلك ، تم إنشاء ثقافة خلايا RPE لدراسة بيولوجيا خلية RPE ، والتغيرات المرضية ، والآليات الأساسية.
كأبسط نموذج لدراسة بيولوجيا الخلية ، بدأت ثقافة خلايا RPE في وقت مبكر من 1920s8. على الرغم من أن ARPE-19 يستخدم على نطاق واسع كخلايا RPE ، إلا أن فقدان التصبغ ، ومورفولوجيا الحصى ، وخاصة وظائف الحاجز في خط الخلية هذا تثير الكثير من المخاوف9. وبالمقارنة ، فإن ثقافة خلايا RPE البشرية الأولية تقدم سيناريو أكثر واقعية للدراسات الفسيولوجية والمرضية9. ومع ذلك ، فإن التوافر المحدود نسبيا يقيد استخدامها والقضايا الأخلاقية موجودة دائما. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت عدة مجموعات نماذج الماوس لزراعة خلايا RPE. ومع ذلك ، فإن حجم عين الفأر صغير ، وعادة ما تتطلب ثقافة واحدة العديد من الفئران ، وهو أمر غير مناسب9. في الآونة الأخيرة ، طور العلماء طرقا جديدة لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لاشتقاق خلايا RPE. على الرغم من أن هذه التقنية لها إمكانات خاصة لعلاج اضطرابات RPE الموروثة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا وعادة ما تتطلب عدة أشهر لتوليد خلايا RPE الناضجة10. للتغلب على هذه المشاكل ، نقدم هنا بروتوكولا سهل المتابعة لعزل وزراعة خلايا RPE عالية النقاء في المختبر بشكل روتيني. في ظل ظروف الثقافة المناسبة ، يمكن لهذه الخلايا عرض وظائف RPE النموذجية وإظهار أشكال RPE النموذجية. لذلك ، يمكن أن توفر طريقة الاستزراع هذه نموذجا جيدا لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة السمية الخلوية ، والتحقيق في الآليات المرضية لأمراض العين ذات الصلة ، وإجراء فحوصات الأدوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية المصطبغة المستقطبة ، وتقع بين المشيمية والشبكية العصبية في شبكية العين. يتم إجراء وظائف متعددة ، بما في ذلك البلعمة ، ونقل المغذيات / الأيض ، واستقلاب فيتامين أ ، وما إلى ذلك ، بواسطة RPE على أساس يومي. خلايا RPE هي خلايا ظهارية متمايزة نهائيا ذات قدرة تجدد قليلة أو معدومة. يؤدي فقدان خلايا RPE إلى أمراض عيون متعددة تؤدي إلى ضعف البصر ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر. لذلك ، فإن إنشاء نموذج زراعة في المختبر لخلايا RPE الأولية ، والتي تشبه إلى حد كبير RPE في الجسم الحي أكثر من خطوط الخلايا ، أمر بالغ الأهمية للدراسات المميزة والميكانيكية لخلايا RPE. بالنظر إلى حقيقة أن مصدر مقل العيون البشرية محدود ، فإننا ننشئ بروتوكولا لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن فصل خلايا RPE بسهولة عن مقل عيون الخنازير البالغة. بعد ذلك ، تلتصق هذه الخلايا المنفصلة بأطباق / إدخالات الثقافة ، وتتكاثر لتشكل طبقة أحادية متقاربة ، وتعيد بسرعة إنشاء السمات الرئيسية للأنسجة الظهارية في الجسم الحي في غضون 2 أسبوع. بواسطة qRT-PCR ، ثبت أن خلايا RPE الخنازير الأولية تعبر عن جينات توقيع متعددة بمستويات مماثلة مع أنسجة RPE الأصلية ، في حين أن تعبيرات معظم هذه الجينات تضيع / تنخفض بشكل كبير في الخلايا البشرية الشبيهة ب RPE ، ARPE-19. علاوة على ذلك ، يظهر تلطيخ التألق المناعي توزيع الوصلة الضيقة ، وقطبية الأنسجة ، وبروتينات الهيكل الخلوي ، بالإضافة إلى وجود RPE65 ، وهو إيزوميراز مهم لعملية التمثيل الغذائي لفيتامين أ ، في الخلايا الأولية المستزرعة. إجمالا ، قمنا بتطوير نهج سهل المتابعة لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية ذات النقاء العالي وميزات RPE الأصلية ، والتي يمكن أن تكون بمثابة نموذج جيد لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة سمية الخلايا ، وتسهيل فحوصات الأدوية.

تم استزراع خلايا RPE الخنازير الأولية (pRPE) في وسائط DMEM / Basic بنسبة 10٪ FBS ، وتم تصوير مورفولوجيا الخلية تحت المجهر الضوئي في يومين (الشكل 2A) و 6 أيام (الشكل 2B) و 10 أيام (الشكل 2C) بعد البذر. بعد 1 أسبوع ، لوحظت طبقة أحادية متقاربة من خلايا pRPE المصطبغة مع...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

هنا ، يتم تقديم طريقة سهلة المتابعة لزراعة الخلايا الظهارية الصبغية الصبغية الأولية في المختبر في المختبر .

الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

تظل الاضطرابات المرتبطة ب RPE جزءا رئيسيا من مزج الأمراض ، ولكن بدون بقايا فعالة في الثقافة الافتراضية لخلايا RPE الأولية لتكون بمثابة نموذج جيد للدراسات الفسيولوجية والمرضية للاضطرابات المرتبطة ب RPE. في هذا البروتوكول ، نقدم بروتوكولا سهل المتابعة لزرع IPCs الأولية ، والذي يمكنه استعادة خصائص RP اللاحقة والحفاظ عليها بسرعة ، ونحن نعتقد أنه باستخدام هذه الطريقة يمكن للناس توليد خلايا RP بسرعة من دراسات macistate وفحوصات الأدوية الوقائية التي يمكن أن تسهل تطوير علاج جديد لاضطرابات RPE. سيجعل عرض القيمة خطوة بخطوة هذه الطريقة أسهل بكثير للتكرار في المختبرات المختلفة التي ترغب في دراسة خلايا RP.لبدء ذوبان الجليد إنزيم هضم الأنسجة malaquad وتعقيم 1X PBS. مكمل ب 2٪ بنسلين و 2٪ ستربتومايسين عن طريق تصفية المحلول من خلال وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر. اغسل آبار لوحة الثقافة وإدراج transwell مع 1X PBS.قم بإزالة PBS من الآبار و transwells باستخدام ماصة وإضافة ملليلتر واحد من 1X PBS الطازج إلى الغرفة السفلية و 600 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من محلول Laminin إلى الغرفة العلوية. احتضان الألواح وإدراج transwell في حاضنة زراعة الحلزون هذه طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول الرقائقي من الغرفة العلوية واغسله بملليلتر واحد من 1X PBS البارد مرتين قبل الجلوس في الخلية نظف غطاء التدفق الرقائقي بنسبة 75٪ من الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية.قم بإعداد ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر تحتوي على حوالي 25 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 75٪ ، وثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر تحتوي على حوالي 25 ملليلتر من 1X PBS ، وثلاثة أطباق لثقافة الخلايا المعقمة 10 سم تحتوي على حوالي 15 ملليلتر من 1X PBS. انقع أربعة مقل عيون خنزيرية في حوالي 15 ملليلتر من 75٪ إيثانول في طبق بتري 10 سم واستخدم مقصا وملقطا لقطع جميع الأنسجة الضامة والعضلات المتبقية. لتطهير مقل العيون ، نقع وغسل أربعة مقل العيون في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر مملوءة بنسبة 75٪ من الإيثانول بالتتابع.ثم اغسل مقل العيون في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر مملوءة ب 1X PBS بالتتابع. اقلب الأنابيب كل دقيقة لغسل مقل العيون جيدا. انقل مقل العيون الأربعة إلى طبق زراعة خلايا معقمة 10 سم يحتوي على 1X PBS.تقليم السطح الخارجي لكل مقلة العين مرة أخرى ، لإزالة العصب البصري والحطام الصغير. استخدم المقص لعمل قطع صغير عند تقاطع النسيان والصلبة. ثم قم بإزالة القرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي والشبكية العصبية.انقل مركب الصلبة المشيمية RPE إلى طبق جديد لزراعة الخلايا يبلغ طوله 10 سم وقم بعمل أربع قطع لتسطيح كوب العين على شكل برسيم من أربع أوراق. قم بإجراء رحلات في هضم محلول EDTA عن طريق وضع مجمعات الصلبة المشيمية الأربعة RPE في طبق جديد يبلغ طوله 10 سم وسكب 20 ملليلترا من محلول EDTA التربسين الطازج لدمج مجمعات الصلبة المشيمية RPE. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا.بعد 30 دقيقة ، أخرج الطبق من الحاضنة ، وأضف 20 ملليلترا من وسائط زراعة الخلايا قبل التسخين مع 10٪ FBS إلى الطبق. لتحييد الرحلات في محلول EDTA ، استخدم ماصة نقل سعة خمسة ملليلتر لفصل خلايا RPE عن طريق السحب برفق عدة مرات. اجمع معلقات الخلية في أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر، ثم الصق برفق 10 ملليلتر أخرى من وسائط الاستزراع الطازجة باستخدام FBS لغسل مجمعات RPE Choroids الصلبة على الطبق.اجمع خلايا RPE عن طريق الطرد المركزي للأنابيب عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشاق SuperAgent باستخدام ماصة وإضافة خمسة ملليلتر أخرى من وسائط المزرعة مع FBS لإعادة تعليق الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 غرام لمدة خمس دقائق أخرى.صب SuperAgent وأعد تعليق الخلايا ب 12 ملليلتر من وسائط الثقافة. البذور التالية 100،000 إلى 200،000 خلية لكل بئر في 12 لوحة استزراع البئر أو إدراج transwell. قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين وتقليل تركيز المصل إلى 1٪ عندما تغطي الخلايا سطح الآبار بالكامل لكل إدخال.قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين حتى يتم حصاد الخلايا. الصور التمثيلية لخلايا RPE الخنازير الأولية في اليوم الثاني واليوم السادس واليوم 10 موضحة هنا. تم الكشف عن تحليل QRTPCR لمستويات mRNA للجينات المميزة في خلايا RPE الخنازير الأولية ، وخلايا RPE البشرية الأولية ، وخلايا ARPE 19 والأنسجة المشيمية RPE الخنازير من خلال هذه الصورة الرسومية.هنا تم استخدام GAP DH كجين التدبير المنزلي ل RTPCR. تم استخدام أربعة مكررات بيولوجية لخلايا RPE الخنازير الأولية وخلايا RPE 19 حيث تم استخدام ثلاث نسخ بيولوجية لخلايا RPE البشرية الأولية وأنسجة المشيمية RPE الخنازير. تم تعيين مستويات التعبير الجيني في خلايا ARPE 19 كعناصر تحكم.يظهر في هذا الشكل تحليل الدم الغربي لبروتينات RPE 65 في ARPE 19 وخلايا RPE الخنازير وفي خلايا RPE البشرية الأولية وأنسجة RPE المشيمية الخنازيرية. تم استخدام Vinculin هنا كعنصر تحكم في التحميل. يوضح هذا الشكل ثقافة لمدة أسبوعين لخلايا RPE الخنازير في وسائط DMEM الأساسية مع 1٪ FBS.كانت الخلايا المستزرعة مع أو بدون Lamin ملطخة ب RPE 65 و APTAs البوتاسيوم الصوديوم و Z01 و Hex. يتم تصوير قياسات TR في صفائح الخلايا ، المزروعة مع أو بدون laminin في هذا الشكل. يظهر في هذا الشكل تحليل الدم الغربي لعامل نمو بطانة الأوعية الدموية أو VEGF وعامل مشتق من ظهارة الصباغ أو PEDF في خلايا RPE و ARPE 19 الأولية للخنازير.يتم عرض الوظائف القطاعية لخلايا RPE و ARPE 19 المزروعة في هذه الصور. الجزء الأكبر من هذا البروتوكول هو إذابة خلايا RP من مجمعات جليد RPE. نوصي باستخدام رحلات ومحلول جديد في كل مرة والتحكم بشكل صحيح في وقت الهضم ، لإذابة ثماني خلايا RP.

primary-culture-of-porcine-retinal-pigment-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

سوبريتينال زرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

العزلة والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصباغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and proliferative vitreoretinopathy (PVR). Since RPE are highly metabolically-active cells, alterations in their metabolic status reflect changes in their health and function. High-resolution respirometry allows for real-time kinetic analysis of the two major bioenergetic pathways, glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), through quantification of the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), respectively. The following is an optimized protocol for conducting high-resolution respirometry on primary human retinal pigment epithelial cells (H-RPE). This protocol provides a detailed description of the steps involved in producing bioenergetic profiles of RPE to define their basal and maximal OXPHOS and glycolytic capacities. Exposing H-RPE to different drug injections targeting the mitochondrial and glycolytic machinery results in defined bioenergetic profiles, from which key metabolic parameters can be calculated. This protocol highlights the enhanced response of BAM15 as an uncoupling agent compared to carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) to induce the maximal respiration capacity in RPE. This protocol can be utilized to study the bioenergetic status of RPE under different disease conditions and test the efficacy of novel drugs in restoring the basal metabolic status of RPE.

The metabolic status of human retinal pigment epithelial cells (H-RPE) reflects their health and function. Presented here is an optimized protocol for examining the real-time metabolic flux of H-RPE using high-resolution respirometry.

تحليل في الوقت الحقيقي للطاقة الحيوية في الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية الأولية باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

عزل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من عيون خنزير غينيا

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

بروتوكول عزل الخلايا الظهارية الثديية عن الأنسجة البشرية

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

تسليط الضوء على المؤلف: دمج الطب الشرقي والغربي لعلاج التهاب الضرع الحبيبي

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

عزل وثقافة الخلايا الظهارية الثديية البشرية الأولية

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...