Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

يود المؤلفون إظهار امتنانهم واحترامهم لجميع الحيوانات التي تساهم بخلاياها في هذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0111200 ، Yi Liao و Yuan Gao و Grant nos. 2018YFA0107301 ، Wei Li). يشكر المؤلفون Jingru Huang و Xiang You من المختبر المركزي ، كلية الطب ، جامعة شيامن على الدعم الفني في التصوير البؤري.

امتثل استخدام التجارب للوائح جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات إدارة التجارب بجامعة شيامن.
1. تحضير الأجهزة الجراحية التجريبية ، وإنزيم هضم الأنسجة ، ومخزن زراعة الخلايا
<ol><li>قم بإعداد الأجهزة الجراحية التجريبية ، عن طريق ت...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

هنا ، تم وصف بروتوكول مفصل ومحسن لعزل وثقافة وتوصيف خلايا RPE من مقل عيون الخنازير ، والذي يولد نموذجا جيدا للتوصيف المختبري لخلايا RPE ودراسات الاضطرابات المتعلقة ب RPE. تم وصف طرق عزل RPE عن عيون الإنسان والفأر والفئران سابقا23،24،25. ومع ذ?...

تقع ظهارة صبغة الشبكية (RPE) بين المستقبلات الضوئية والمشيمية الشعرية في الطبقة الخارجية من الشبكية1 مع وظائف متعددة ، بما في ذلك تشكيل حاجز الدم والشبكية ، ونقل وتبادل العناصر الغذائية ومستقلبات الشبكية ، وإعادة تدوير فيتامين أ للحفاظ على دورة بصرية طبيعية ، والبلعمة وإزالة الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية (POSs)2,3 . نظرا لأن نقاط البيع تتطلب تجديدا ذاتيا مستمرا لتوليد الرؤية ، فإن خلايا RPE تحتاج إلى ابتلاع نقاط البيع المنفصلة باستمرار للحفاظ على توازن الشبكية4. لذلك ، يؤدي الخلل الوظيفي في RPE إلى العديد من أمراض العيون المسببة للعمى ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)4 ، التهاب الشبكية الصباغي (RP)5 ، داء ليبر الخلقي6 ، اعتلال الشبكية السكري7 ، إلخ. حتى الآن ، لا يزال التسبب الدقيق لمعظم هذه الأمراض بعيد المنال. نتيجة لذلك ، تم إنشاء ثقافة خلايا RPE لدراسة بيولوجيا خلية RPE ، والتغيرات المرضية ، والآليات الأساسية.
كأبسط نموذج لدراسة بيولوجيا الخلية ، بدأت ثقافة خلايا RPE في وقت مبكر من 1920s8. على الرغم من أن ARPE-19 يستخدم على نطاق واسع كخلايا RPE ، إلا أن فقدان التصبغ ، ومورفولوجيا الحصى ، وخاصة وظائف الحاجز في خط الخلية هذا تثير الكثير من المخاوف9. وبالمقارنة ، فإن ثقافة خلايا RPE البشرية الأولية تقدم سيناريو أكثر واقعية للدراسات الفسيولوجية والمرضية9. ومع ذلك ، فإن التوافر المحدود نسبيا يقيد استخدامها والقضايا الأخلاقية موجودة دائما. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت عدة مجموعات نماذج الماوس لزراعة خلايا RPE. ومع ذلك ، فإن حجم عين الفأر صغير ، وعادة ما تتطلب ثقافة واحدة العديد من الفئران ، وهو أمر غير مناسب9. في الآونة الأخيرة ، طور العلماء طرقا جديدة لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لاشتقاق خلايا RPE. على الرغم من أن هذه التقنية لها إمكانات خاصة لعلاج اضطرابات RPE الموروثة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا وعادة ما تتطلب عدة أشهر لتوليد خلايا RPE الناضجة10. للتغلب على هذه المشاكل ، نقدم هنا بروتوكولا سهل المتابعة لعزل وزراعة خلايا RPE عالية النقاء في المختبر بشكل روتيني. في ظل ظروف الثقافة المناسبة ، يمكن لهذه الخلايا عرض وظائف RPE النموذجية وإظهار أشكال RPE النموذجية. لذلك ، يمكن أن توفر طريقة الاستزراع هذه نموذجا جيدا لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة السمية الخلوية ، والتحقيق في الآليات المرضية لأمراض العين ذات الصلة ، وإجراء فحوصات الأدوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية المصطبغة المستقطبة ، وتقع بين المشيمية والشبكية العصبية في شبكية العين. يتم إجراء وظائف متعددة ، بما في ذلك البلعمة ، ونقل المغذيات / الأيض ، واستقلاب فيتامين أ ، وما إلى ذلك ، بواسطة RPE على أساس يومي. خلايا RPE هي خلايا ظهارية متمايزة نهائيا ذات قدرة تجدد قليلة أو معدومة. يؤدي فقدان خلايا RPE إلى أمراض عيون متعددة تؤدي إلى ضعف البصر ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر. لذلك ، فإن إنشاء نموذج زراعة في المختبر لخلايا RPE الأولية ، والتي تشبه إلى حد كبير RPE في الجسم الحي أكثر من خطوط الخلايا ، أمر بالغ الأهمية للدراسات المميزة والميكانيكية لخلايا RPE. بالنظر إلى حقيقة أن مصدر مقل العيون البشرية محدود ، فإننا ننشئ بروتوكولا لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن فصل خلايا RPE بسهولة عن مقل عيون الخنازير البالغة. بعد ذلك ، تلتصق هذه الخلايا المنفصلة بأطباق / إدخالات الثقافة ، وتتكاثر لتشكل طبقة أحادية متقاربة ، وتعيد بسرعة إنشاء السمات الرئيسية للأنسجة الظهارية في الجسم الحي في غضون 2 أسبوع. بواسطة qRT-PCR ، ثبت أن خلايا RPE الخنازير الأولية تعبر عن جينات توقيع متعددة بمستويات مماثلة مع أنسجة RPE الأصلية ، في حين أن تعبيرات معظم هذه الجينات تضيع / تنخفض بشكل كبير في الخلايا البشرية الشبيهة ب RPE ، ARPE-19. علاوة على ذلك ، يظهر تلطيخ التألق المناعي توزيع الوصلة الضيقة ، وقطبية الأنسجة ، وبروتينات الهيكل الخلوي ، بالإضافة إلى وجود RPE65 ، وهو إيزوميراز مهم لعملية التمثيل الغذائي لفيتامين أ ، في الخلايا الأولية المستزرعة. إجمالا ، قمنا بتطوير نهج سهل المتابعة لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية ذات النقاء العالي وميزات RPE الأصلية ، والتي يمكن أن تكون بمثابة نموذج جيد لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة سمية الخلايا ، وتسهيل فحوصات الأدوية.

تم استزراع خلايا RPE الخنازير الأولية (pRPE) في وسائط DMEM / Basic بنسبة 10٪ FBS ، وتم تصوير مورفولوجيا الخلية تحت المجهر الضوئي في يومين (الشكل 2A) و 6 أيام (الشكل 2B) و 10 أيام (الشكل 2C) بعد البذر. بعد 1 أسبوع ، لوحظت طبقة أحادية متقاربة من خلايا pRPE المصطبغة مع...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

هنا ، يتم تقديم طريقة سهلة المتابعة لزراعة الخلايا الظهارية الصبغية الصبغية الأولية في المختبر في المختبر .

الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

تظل الاضطرابات المرتبطة ب RPE جزءا رئيسيا من مزج الأمراض ، ولكن بدون بقايا فعالة في الثقافة الافتراضية لخلايا RPE الأولية لتكون بمثابة نموذج جيد للدراسات الفسيولوجية والمرضية للاضطرابات المرتبطة ب RPE. في هذا البروتوكول ، نقدم بروتوكولا سهل المتابعة لزرع IPCs الأولية ، والذي يمكنه استعادة خصائص RP اللاحقة والحفاظ عليها بسرعة ، ونحن نعتقد أنه باستخدام هذه الطريقة يمكن للناس توليد خلايا RP بسرعة من دراسات macistate وفحوصات الأدوية الوقائية التي يمكن أن تسهل تطوير علاج جديد لاضطرابات RPE. سيجعل عرض القيمة خطوة بخطوة هذه الطريقة أسهل بكثير للتكرار في المختبرات المختلفة التي ترغب في دراسة خلايا RP.لبدء ذوبان الجليد إنزيم هضم الأنسجة malaquad وتعقيم 1X PBS. مكمل ب 2٪ بنسلين و 2٪ ستربتومايسين عن طريق تصفية المحلول من خلال وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر. اغسل آبار لوحة الثقافة وإدراج transwell مع 1X PBS.قم بإزالة PBS من الآبار و transwells باستخدام ماصة وإضافة ملليلتر واحد من 1X PBS الطازج إلى الغرفة السفلية و 600 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من محلول Laminin إلى الغرفة العلوية. احتضان الألواح وإدراج transwell في حاضنة زراعة الحلزون هذه طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول الرقائقي من الغرفة العلوية واغسله بملليلتر واحد من 1X PBS البارد مرتين قبل الجلوس في الخلية نظف غطاء التدفق الرقائقي بنسبة 75٪ من الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية.قم بإعداد ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر تحتوي على حوالي 25 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 75٪ ، وثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر تحتوي على حوالي 25 ملليلتر من 1X PBS ، وثلاثة أطباق لثقافة الخلايا المعقمة 10 سم تحتوي على حوالي 15 ملليلتر من 1X PBS. انقع أربعة مقل عيون خنزيرية في حوالي 15 ملليلتر من 75٪ إيثانول في طبق بتري 10 سم واستخدم مقصا وملقطا لقطع جميع الأنسجة الضامة والعضلات المتبقية. لتطهير مقل العيون ، نقع وغسل أربعة مقل العيون في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر مملوءة بنسبة 75٪ من الإيثانول بالتتابع.ثم اغسل مقل العيون في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر مملوءة ب 1X PBS بالتتابع. اقلب الأنابيب كل دقيقة لغسل مقل العيون جيدا. انقل مقل العيون الأربعة إلى طبق زراعة خلايا معقمة 10 سم يحتوي على 1X PBS.تقليم السطح الخارجي لكل مقلة العين مرة أخرى ، لإزالة العصب البصري والحطام الصغير. استخدم المقص لعمل قطع صغير عند تقاطع النسيان والصلبة. ثم قم بإزالة القرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي والشبكية العصبية.انقل مركب الصلبة المشيمية RPE إلى طبق جديد لزراعة الخلايا يبلغ طوله 10 سم وقم بعمل أربع قطع لتسطيح كوب العين على شكل برسيم من أربع أوراق. قم بإجراء رحلات في هضم محلول EDTA عن طريق وضع مجمعات الصلبة المشيمية الأربعة RPE في طبق جديد يبلغ طوله 10 سم وسكب 20 ملليلترا من محلول EDTA التربسين الطازج لدمج مجمعات الصلبة المشيمية RPE. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا.بعد 30 دقيقة ، أخرج الطبق من الحاضنة ، وأضف 20 ملليلترا من وسائط زراعة الخلايا قبل التسخين مع 10٪ FBS إلى الطبق. لتحييد الرحلات في محلول EDTA ، استخدم ماصة نقل سعة خمسة ملليلتر لفصل خلايا RPE عن طريق السحب برفق عدة مرات. اجمع معلقات الخلية في أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر، ثم الصق برفق 10 ملليلتر أخرى من وسائط الاستزراع الطازجة باستخدام FBS لغسل مجمعات RPE Choroids الصلبة على الطبق.اجمع خلايا RPE عن طريق الطرد المركزي للأنابيب عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشاق SuperAgent باستخدام ماصة وإضافة خمسة ملليلتر أخرى من وسائط المزرعة مع FBS لإعادة تعليق الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 غرام لمدة خمس دقائق أخرى.صب SuperAgent وأعد تعليق الخلايا ب 12 ملليلتر من وسائط الثقافة. البذور التالية 100،000 إلى 200،000 خلية لكل بئر في 12 لوحة استزراع البئر أو إدراج transwell. قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين وتقليل تركيز المصل إلى 1٪ عندما تغطي الخلايا سطح الآبار بالكامل لكل إدخال.قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين حتى يتم حصاد الخلايا. الصور التمثيلية لخلايا RPE الخنازير الأولية في اليوم الثاني واليوم السادس واليوم 10 موضحة هنا. تم الكشف عن تحليل QRTPCR لمستويات mRNA للجينات المميزة في خلايا RPE الخنازير الأولية ، وخلايا RPE البشرية الأولية ، وخلايا ARPE 19 والأنسجة المشيمية RPE الخنازير من خلال هذه الصورة الرسومية.هنا تم استخدام GAP DH كجين التدبير المنزلي ل RTPCR. تم استخدام أربعة مكررات بيولوجية لخلايا RPE الخنازير الأولية وخلايا RPE 19 حيث تم استخدام ثلاث نسخ بيولوجية لخلايا RPE البشرية الأولية وأنسجة المشيمية RPE الخنازير. تم تعيين مستويات التعبير الجيني في خلايا ARPE 19 كعناصر تحكم.يظهر في هذا الشكل تحليل الدم الغربي لبروتينات RPE 65 في ARPE 19 وخلايا RPE الخنازير وفي خلايا RPE البشرية الأولية وأنسجة RPE المشيمية الخنازيرية. تم استخدام Vinculin هنا كعنصر تحكم في التحميل. يوضح هذا الشكل ثقافة لمدة أسبوعين لخلايا RPE الخنازير في وسائط DMEM الأساسية مع 1٪ FBS.كانت الخلايا المستزرعة مع أو بدون Lamin ملطخة ب RPE 65 و APTAs البوتاسيوم الصوديوم و Z01 و Hex. يتم تصوير قياسات TR في صفائح الخلايا ، المزروعة مع أو بدون laminin في هذا الشكل. يظهر في هذا الشكل تحليل الدم الغربي لعامل نمو بطانة الأوعية الدموية أو VEGF وعامل مشتق من ظهارة الصباغ أو PEDF في خلايا RPE و ARPE 19 الأولية للخنازير.يتم عرض الوظائف القطاعية لخلايا RPE و ARPE 19 المزروعة في هذه الصور. الجزء الأكبر من هذا البروتوكول هو إذابة خلايا RP من مجمعات جليد RPE. نوصي باستخدام رحلات ومحلول جديد في كل مرة والتحكم بشكل صحيح في وقت الهضم ، لإذابة ثماني خلايا RP.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

الأمثل الفيروسة البطيئة إنتاج وزراعة الخلايا الشروط الضرورية لبنجاح خلايا تنبيغ الإنسان الشعبي الأساسي طلائي

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

سوبريتينال زرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

العزلة والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصباغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

تحليل في الوقت الحقيقي للطاقة الحيوية في الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية الأولية باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...