Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

De auteurs willen graag hun dankbaarheid en respect tonen voor alle dieren die hun cellen bijdragen aan deze studie. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Key R &D-programma van China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao en Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). De auteurs bedanken Jingru Huang en Xiang You van Central Lab, School of Medicine, Xiamen University voor technische ondersteuning bij confocale beeldvorming.

Het gebruik van proefdieren voldeed aan de voorschriften van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) en werd goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Experimenteel Dierbeheer van xiamen University.
1. Voorbereiding van experimentele chirurgische apparaten, weefselverteringsenzym en celkweekbuffer
<ol><li>Bereid de experimentele chirurgische apparaten voor door twee paar oogheelkundige chirurgische scharen en tangen de dag voor de oogboldissectie te ...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

Hier is een gedetailleerd en geoptimaliseerd protocol beschreven voor de isolatie, kweek en karakterisering van RPE-cellen uit varkensoogbollen, dat een goed model genereert voor in vitro karakterisering van RPE-cellen en RPE-gerelateerde stoornisstudies. Methoden voor de isolatie van de RPE van menselijke, muis- en rattenogen zijn eerder beschreven 23,24,25. Het is echter moeilijk om menselijke oogbollen te verkrijgen ...

Het retinale pigmentepitheel (RPE) bevindt zich tussen fotoreceptoren en choriocapillaris in de buitenste laag van het netvlies1 met meerdere functies, waaronder het vormen van de bloed-retinale barrière, het transporteren en uitwisselen van voedingsstoffen en retinale metabolieten, het recyclen van vitamine A om een normale visuele cyclus te behouden, en fagocytose en klaring van afgeworpen fotoreceptor buitenste segmenten (POSs)2,3 . Omdat POS'en constante zelfvernieuwing vereisen om visie te genereren, moeten de RPE-cellen continu losgemaakte POS'en overspoelen om retinale homeostase te behouden4. Daarom resulteert RPE-disfunctie in veel verblindende oogziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber congenitale amaurosis6, diabetische retinopathie7, enz. Tot nu toe blijft de exacte pathogenese van de meeste van deze ziekten ongrijpbaar. Als gevolg hiervan wordt RPE-celcultuur opgericht om RPE-celbiologie, pathologische veranderingen en onderliggende mechanismen te bestuderen.
Als het eenvoudigste model om celbiologie te bestuderen, werd de kweek van RPE-cellen al in de jaren 1920 gestart8. Hoewel ARPE-19 veel wordt gebruikt als RPE-cellen, roepen verlies van pigmentatie, kasseimorfologie en vooral de barrièrefuncties in deze cellijn veel zorgen op9. Ter vergelijking: de kweek van primaire menselijke RPE-cellen biedt een realistischer scenario voor fysiologische en pathologische studies9. De relatief beperkte beschikbaarheid beperkt echter het gebruik ervan en ethische kwesties bestaan altijd. Daarnaast gebruikten verschillende groepen muismodellen om RPE-cellen te kweken. De grootte van het muizenoog is echter klein en een enkele cultuur vereist meestal veel muizen, wat niet handig is9. Onlangs hebben wetenschappers nieuwe methoden ontwikkeld om menselijke embryonale stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen te gebruiken om RPE-cellen af te leiden. Hoewel deze techniek een bijzonder potentieel heeft voor de behandeling van erfelijke RPE-aandoeningen, is het tijdrovend en duurt het meestal enkele maanden om volwassen RPE-cellen te genereren10. Om deze problemen te overwinnen, introduceren we hier een eenvoudig te volgen protocol om RPE-cellen met een hoge zuiverheidsgraad routinematig in het laboratorium te isoleren en te kweken. Onder geschikte kweekomstandigheden kunnen deze cellen typische RPE-functies weergeven en typische RPE-morfologieën vertonen. Daarom kan deze kweekmethode een goed model bieden om de RPE-fysiologie te begrijpen, cytotoxiciteit te bestuderen, pathologische mechanismen van gerelateerde oogziekten te onderzoeken en medicijnscreenings uit te voeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag van gepolariseerde gepigmenteerde epitheelcellen, gelegen tussen het vaatvlies en neuroretina in het netvlies. Meerdere functies, waaronder fagocytose, transport van voedingsstoffen / metabolieten, vitamine A-metabolisme, enz., Worden dagelijks door de RPE uitgevoerd. RPE-cellen zijn terminaal gedifferentieerde epitheelcellen met weinig of geen regeneratief vermogen. Verlies van RPE-cellen resulteert in meerdere oogziekten die leiden tot visuele beperkingen, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. Daarom is de vaststelling van een in vitro kweekmodel van primaire RPE-cellen, dat meer lijkt op de RPE in vivo dan cellijnen, van cruciaal belang voor de karakteristieke en mechanistische studies van RPE-cellen. Gezien het feit dat de bron van menselijke oogbollen beperkt is, maken we een protocol om primaire varkens RPE-cellen te kweken. Door dit protocol te gebruiken, kunnen RPE-cellen gemakkelijk worden gedissocieerd van volwassen varkensoogbollen. Vervolgens hechten deze gedissocieerde cellen zich aan kweekschalen / inserts, prolifereren zich om een confluente monolaag te vormen en herstellen snel de belangrijkste kenmerken van epitheelweefsel in vivo binnen 2 weken. Door qRT-PCR wordt aangetoond dat RPE-cellen van primaire varkens meerdere signatuurgenen tot expressie brengen op vergelijkbare niveaus met inheems RPE-weefsel, terwijl de expressies van de meeste van deze genen verloren gaan / sterk verminderd zijn in menselijke RPE-achtige cellen, ARPE-19. Bovendien toont de immunofluorescentiekleuring de verdeling van tight junction, weefselpolariteit en cytoskeleteiwitten, evenals de aanwezigheid van RPE65, een isomerase dat cruciaal is voor het vitamine A-metabolisme, in gekweekte primaire cellen. Al met al hebben we een eenvoudig te volgen benadering ontwikkeld om primaire varkens RPE-cellen te kweken met een hoge zuiverheid en native RPE-kenmerken, die zou kunnen dienen als een goed model om RPE-fysiologie te begrijpen, celtoxiciteiten te bestuderen en medicijnscreenings te vergemakkelijken.

De primaire varkens RPE (pRPE) cellen werden gekweekt in DMEM/Basic media met 10% FBS, en celmorfologie onder lichtmicroscoop werd gefotografeerd op 2 dagen (figuur 2A), 6 dagen (figuur 2B) en 10 dagen (figuur 2C) na het zaaien. Na 1 week werd een confluente monolaag van gepigmenteerde pRPE-cellen met kasseimorfologieën waargenomen.
Om de primaire pRPE-cellen beter te karakteriseren, werden primaire mens...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Hier wordt een eenvoudig te volgen methode gepresenteerd om primaire retinale pigmentepitheelcellen van varkens in vitro te kweken.

Primaire cultuur van porcine retinale pigmentepitheelcellen

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

RPE-gerelateerde aandoeningen blijven een belangrijk onderdeel van het mengen van ziekten, maar zonder effectieve overblijfselen in virtuele cultuur van primaire RPE-cellen om te dienen als een goed model voor fysiologische en pathologische studies van RPE-gerelateerde aandoeningen. In dit protocol bieden we een eenvoudig te volgen protocol om primaire IPC's te kweken, die later RP-kenmerken snel kunnen herstellen en behouden, wij geloven dat door deze methode te gebruiken mensen snel RP-cellen kunnen genereren uit macistaatstudies en de beschermende medicijnscreenings die de ontwikkeling van nieuwe behandeling voor RPE-stoornissen zouden kunnen vergemakkelijken. Een stapsgewijze waardedemonstratie zal deze methode veel gemakkelijker te repliceren maken in verschillende laboratoria die RP-cellen willen bestuderen.Om te beginnen met het ontdooien van het weefselverteringsenzym malaquad en steriliseren 1X PBS. Aangevuld met 2% penicilline en 2% streptomycine door de oplossing door een 0,22 micrometer spuitfiltereenheid te filteren. Was de putjes van de kweekplaat en transwell inzetstukken met 1X PBS.Verwijder de PBS uit de putjes en transwells met een pipet en voeg een milliliter verse 1X PBS toe aan de onderste kamer en 600 microliter laminineoplossing van 10 microliter per milliliter laminineoplossing aan de bovenkamer. Incubeer de platen en transwell inserts in deze Heliciculture Incubator 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder daarna de laminaatoplossing uit de bovenste kamer en was tweemaal met een milliliter koude 1X PBS voordat u de cel plaatst Reinig de laminaatstroomkap met 75% ethanol en UV-licht.Bereid drie steriele centrifugebuizen van 50 milliliter met ongeveer 25 milliliter 75% ethanol, drie steriele centrifugebuizen van 50 milliliter met ongeveer 25 milliliter 1X PBS en drie steriele celkweekschalen van 10 centimeter met ongeveer 15 milliliter 1X PBS. Week vier varkensoogbollen in ongeveer 15 milliliter 75% Ethanol in een petrischaaltje van 10 centimeter en gebruik een schaar en tang om alle resterende bindweefsels en spieren af te snijden. Om de oogbollen te ontsmetten, week en was vier oogbollen in drie steriele centrifugebuizen van 50 milliliter die achtereenvolgens gevuld zijn met 75% ethanol.Was vervolgens de oogbollen in drie steriele centrifugebuizen van 50 milliliter die achtereenvolgens gevuld zijn met 1X PBS. Keer de buisjes elke minuut om om de oogbollen grondig te wassen. Verplaats de vier oogbollen in een steriele celkweekschaal van 10 centimeter met 1X PBS.Snijd het buitenoppervlak van elke oogbol opnieuw bij om de oogzenuw en kleine brokstukken te verwijderen. Gebruik een schaar om een kleine snede te maken op het snijpunt van de limbus en sclera. En verwijder vervolgens het hoornvlies, de iris, de lens, het glasachtig lichaam en het neurale netvlies.Breng het RPE-choroïde scleracomplex over in een nieuwe celkweekschaal van 10 centimeter en maak vier sneden om de oogschelp plat te maken in de vorm van een klavertje vier. Voer trips uit in de vertering van EDTA-oplossingen door de vier RPE-choroïde scleracomplexen in een nieuwe schaal van 10 centimeter te plaatsen en 20 milliliter verse trypsine EDTA-oplossing te gieten om de RPE-choroïde scleracomplexen samen te voegen. Plaats het gerecht in de celkweekincubator op 37 graden Celsius gedurende bijna 30 minuten.Haal na 30 minuten het gerecht uit de incubator en voeg 20 milliliter voorverwarmde celkweekmedia met 10% FBS toe aan het gerecht. Om de trips in EDTA-oplossing te neutraliseren, gebruikt u een transferpipet van vijf milliliter om de RPE-cellen te dissociëren door meerdere keren voorzichtig te pipetteren. Verzamel de celsuspensies in centrifugebuizen van 15 milliliter en pipetteer vervolgens voorzichtig nog eens 10 milliliter verse kweekmedia met FBS om de Sclera-complexen van RPE Choroids op de schaal te wassen.Verzamel de RPE-cellen door de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 300 G te centrifugeren. Aspirateer de SuperAgent met behulp van een pipet en voeg nog eens vijf milliliter kweekmedia toe met FBS om de cellen opnieuw op te hangen. Centrifugeer bij 300 G gedurende nog eens vijf minuten.Decanteer de SuperAgent en hang de cellen opnieuw op met 12 milliliter kweekmedia. Zaai vervolgens 100.000 tot 200.000 cellen per put in 12 Putkweekplaten of transwell inzetstukken. Verander de kweekmedia om de twee dagen en verlaag de serumconcentratie tot 1% wanneer de cellen het oppervlak van de putten per insert volledig bedekken.Verander de kweekmedia om de twee dagen totdat de cellen zijn geoogst. De representatieve beelden van primaire varkens RPE-cellen op dag twee, dag zes en dag 10 worden hier getoond. De QRTPCR-analyse van mRNA-niveaus van kenmerkende genen in primaire varkens RPE-cellen, primaire menselijke RPE-cellen, ARPE 19-cellen en varkens RPE-chorovarioïde weefsel wordt gedetecteerd door deze grafische afbeelding.Hier werd GAP DH gebruikt als het huishoudgen voor RTPCR. Vier biologische replicaties werden gebruikt voor primaire RPE-cellen van varkens en een RPE 19-cellen waarbij drie biologische replicaties werden gebruikt voor primaire menselijke RPE-cellen en RPE-vaatweefsel van varkens. De genexpressieniveaus in ARPE 19-cellen werden ingesteld als controles.De westerse bloedanalyse van RPE 65-eiwitten in ARPE 19- en varkens-RPE-cellen en in primaire menselijke RPE-cellen en varkens RPE-vaatvliesweefsels wordt in deze figuur weergegeven. Vinculin werd hier gebruikt als beladingscontrole. Deze figuur toont een twee weken durende kweek van varkens RPE-cellen in DMEM Basic media met 1% FBS.Cellen gekweekt met of zonder Lamin werden gekleurd met RPE 65, natriumkalium APTAs, Z01 en Hex. TR-metingen in celvellen, gekweekt met of zonder laminine, zijn in deze figuur afgebeeld. De westerse bloedanalyse van vasculaire endotheelgroeifactor of VEGF en pigmentepitheel afgeleide factor of PEDF in primaire varkens RPE- en ARPE 19-cellen worden in deze figuur weergegeven.De sectoriële functies van gekweekte primaire varkens RPE- en ARPE 19-cellen worden in deze afbeeldingen gepresenteerd. Het grootste deel van dit protocol is het oplossen van RP-cellen uit RPE chide glial complexen. We raden aan om elke keer verse trips en oplossing te gebruiken en de verteertijd goed te regelen, om acht RP-cellen op te lossen.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primaire celculturen van de muis retinale Pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

Isolatie van retinale pigmentepitheelcellen uit caviaogen

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

Protocol voor het isoleren van borstepitheelcellen uit menselijk weefsel

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

Auteur in de schijnwerpers: integratie van oosterse en westerse geneeskunde voor de behandeling van granulomateuze mastitis

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...