Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
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Les auteurs aimeraient montrer leur gratitude et leur respect à tous les animaux qui apportent leurs cellules dans cette étude. Cette étude a été financée en partie par des subventions du National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao et Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Les auteurs remercient Jingru Huang et Xiang You du laboratoire central de la faculté de médecine de l’Université de Xiamen pour leur soutien technique en imagerie confocale.

L’utilisation d’animaux de laboratoire était conforme aux règlements de l’Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) et a été approuvée par le Comité d’éthique de la gestion des animaux expérimentaux de l’Université de Xiamen.
1. Préparation de dispositifs chirurgicaux expérimentaux, d’enzymes de digestion tissulaire et de tampons de culture cellulaire
<ol><li>Préparer les dispositifs chirurgicaux expérimentaux, en nettoyant et e...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

Ici, un protocole détaillé et optimisé pour l’isolement, la culture et la caractérisation des cellules EPR à partir de globes oculaires porcins, qui génère un bon modèle pour la caractérisation in vitro des cellules EPR et les études sur les troubles liés à l’EPR, a été décrit. Des méthodes d’isolement de l’EPR à partir d’yeux humains, de souris et de rats ont été décrites précédemment23,24,25<...

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est situé entre les photorécepteurs et la choriocapillarise dans la couche externe de la rétine1 avec de multiples fonctions, y compris la formation de la barrière hémato-rétinienne, le transport et l’échange de nutriments et de métabolites rétiniens, le recyclage de la vitamine A pour maintenir un cycle visuel normal, et la phagocytose et la clairance des segments externes des photorécepteurs (POS)2,3 . Étant donné que les PDV nécessitent un auto-renouvellement constant pour générer la vision, les cellules EPR doivent continuellement engloutir les POS détachés pour maintenir l’homéostasie rétinienne4. Par conséquent, le dysfonctionnement de l’EPR entraîne de nombreuses maladies oculaires cécitantes, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)4, la rétinite pigmentaire (RP)5, l’amaurose congénitale de Leber6, la rétinopathie diabétique7, etc. Jusqu’à présent, la pathogenèse exacte de la plupart de ces maladies reste insaisissable. En conséquence, la culture cellulaire RPE est établie pour étudier la biologie cellulaire RPE, les changements pathologiques et les mécanismes sous-jacents.
En tant que modèle le plus simple pour étudier la biologie cellulaire, la culture de cellules EPR a commencé dès les années 19208. Bien que l’ARPE-19 soit largement utilisé comme cellules EPR, la perte de pigmentation, la morphologie des pavés et, surtout, les fonctions de barrière dans cette lignée cellulaire soulèvent beaucoup de préoccupations9. En comparaison, la culture de cellules EPR humaines primaires offre un scénario plus réaliste pour les études physiologiques et pathologiques9. Cependant, la disponibilité relativement limitée restreint leur utilisation et des problèmes éthiques existent toujours. En outre, plusieurs groupes ont utilisé des modèles murins pour cultiver des cellules EPR. Cependant, la taille de l’œil de souris est petite et une seule culture nécessite généralement de nombreuses souris, ce qui n’est pas pratique9. Récemment, les scientifiques ont mis au point de nouvelles méthodes pour utiliser des cellules souches embryonnaires humaines ou des cellules souches pluripotentes induites pour dériver des cellules EPR. Bien que cette technique ait un potentiel particulier pour le traitement des troubles héréditaires de l’EPR, elle prend beaucoup de temps et nécessite généralement plusieurs mois pour générer des cellules EPR matures10. Pour surmonter ces problèmes, nous introduisons ici un protocole facile à suivre pour isoler et cultiver régulièrement des cellules EPR de haute pureté en laboratoire. Dans des conditions de culture appropriées, ces cellules peuvent présenter des fonctions RPE typiques et présenter des morphologies RPE typiques. Par conséquent, cette méthode de culture peut fournir un bon modèle pour comprendre la physiologie de l’EPR, étudier la cytotoxicité, étudier les mécanismes pathologiques des maladies oculaires connexes et effectuer des dépistages de médicaments.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales pigmentées polarisées, située entre la choroïde et la neurorétine dans la rétine. De multiples fonctions, y compris la phagocytose, le transport des nutriments / métabolites, le métabolisme de la vitamine A, etc., sont effectuées quotidiennement par l’EPR. Les cellules EPR sont des cellules épithéliales différenciées en phase terminale avec peu ou pas de capacité de régénération. La perte de cellules EPR entraîne de multiples maladies oculaires entraînant une déficience visuelle, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Par conséquent, l’établissement d’un modèle de culture in vitro de cellules EPR primaires, qui ressemble plus à l’EPR in vivo qu’aux lignées cellulaires, est essentiel pour les études caractéristiques et mécanistes des cellules EPR. Compte tenu du fait que la source des globes oculaires humains est limitée, nous créons un protocole pour cultiver des cellules primaires d’EPR porcines. En utilisant ce protocole, les cellules EPR peuvent être facilement dissociées des globes oculaires porcins adultes. Par la suite, ces cellules dissociées se fixent aux boîtes de culture, prolifèrent pour former une monocouche confluente et rétablissent rapidement les principales caractéristiques du tissu épithélial in vivo en 2 semaines. Par qRT-PCR, il est démontré que les cellules RPE porcines primaires expriment plusieurs gènes de signature à des niveaux comparables avec le tissu RPE natif, tandis que les expressions de la plupart de ces gènes sont perdues / fortement réduites dans les cellules humaines de type EPR, ARPE-19. De plus, la coloration par immunofluorescence montre la distribution de la jonction serrée, de la polarité tissulaire et des protéines du cytosquelette, ainsi que la présence de RPE65, une isomérase essentielle au métabolisme de la vitamine A, dans les cellules primaires en culture. Dans l’ensemble, nous avons développé une approche facile à suivre pour la culture de cellules EPR porcines primaires avec des caractéristiques RPE de haute pureté et natives, qui pourrait servir de bon modèle pour comprendre la physiologie de l’EPR, étudier les toxicités cellulaires et faciliter les dépistages de médicaments.

Les cellules primaires de l’EPR porcine (EPRP) ont été cultivées dans un milieu DMEM/Basic avec 10 % de FBS, et la morphologie cellulaire au microscope optique a été photographiée 2 jours (figure 2A), 6 jours (figure 2B) et 10 jours (figure 2C) après l’ensemencement. Après 1 semaine, une monocouche confluente de cellules pRPE pigmentées avec des morphologies pavées a été observée.
Pour mi...

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Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Ici, une méthode facile à suivre pour cultiver in vitro des cellules épithéliales pigmentaires primaires de la rétine porcine est présentée.

Culture primaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Les troubles liés à l’EPR restent une partie importante du mélange des maladies, mais sans restes efficaces dans la culture virtuelle de cellules primaires de l’EPR pour servir de bon modèle pour les études physiologiques et pathologiques des troubles liés à l’EPR. Dans ce protocole, nous fournissons un protocole facile à suivre pour la culture de CPI primaires, qui pourrait rapidement restaurer et maintenir les caractéristiques RP ultérieures, nous croyons qu’en utilisant cette méthode, les gens pourraient rapidement générer des cellules RP à partir d’études de macistate et de criblages de médicaments protecteurs qui pourraient faciliter le développement de nouveaux traitements pour les troubles RPE. Une démonstration étape par étape de la valeur rendra cette méthode beaucoup plus facile à reproduire dans différents laboratoires qui souhaitent étudier les cellules RP.Pour commencer à décongeler l’enzyme de digestion tissulaire malaquad et stériliser 1X PBS. Complété par 2% de pénicilline et 2% de streptomycine en filtrant la solution à travers une unité filtrante à seringue de 0,22 micromètre. Lavez les puits de la plaque de culture et des inserts transwell avec 1X PBS.Retirez le PBS des puits et des puits avec une pipette et ajoutez un millilitre de PBS 1X frais dans la chambre inférieure et 600 microlitres de solution de laminine de 10 microgrammes par millilitre dans la chambre supérieure. Incuber les plaques et les inserts transwell dans cet incubateur hélicicole pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après cela, retirez la solution stratifiée de la chambre supérieure et lavez deux fois avec un millilitre de PBS 1X froid avant d’asseoir la cellule Nettoyez la hotte d’écoulement du stratifié avec de l’éthanol à 75% et de la lumière UV.Préparez trois tubes de centrifugation stériles de 50 millilitres contenant environ 25 millilitres d’éthanol à 75%, trois tubes de centrifugation stériles de 50 millilitres contenant environ 25 millilitres de 1X PBS et trois boîtes de culture cellulaire stérile de 10 centimètres contenant environ 15 millilitres de 1X PBS. Trempez quatre globes oculaires porcins dans environ 15 millilitres d’éthanol à 75% dans une boîte de Petri de 10 centimètres et utilisez une paire de ciseaux et de pinces pour couper tous les tissus conjonctifs et les muscles résiduels. Pour décontaminer les globes oculaires, faites tremper et lavez quatre globes oculaires dans trois tubes centrifugés stériles de 50 millilitres remplis séquentiellement d’éthanol à 75%.Ensuite, lavez les globes oculaires dans trois tubes centrifugés stériles de 50 millilitres remplis de 1X PBS séquentiellement. Inversez les tubes toutes les minutes pour bien laver les globes oculaires. Déplacez les quatre globes oculaires dans une boîte de culture cellulaire stérile de 10 centimètres contenant 1X PBS.Coupez à nouveau la surface externe de chaque globe oculaire pour enlever le nerf optique et les petits débris. Utilisez des ciseaux pour faire une petite coupure à l’intersection du limbe et de la sclérotique. Et puis retirez la cornée, l’iris, le cristallin, le corps vitré et la rétine neurale.Transférer le complexe de sclérotique choroïde RPE dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 10 centimètres et faire quatre coupes pour aplatir la coupelle oculaire en forme de trèfle à quatre feuilles. Effectuer des voyages dans la digestion de la solution d’EDTA en plaçant les quatre complexes de sclérotique choroïde RPE dans un nouveau plat de 10 centimètres et en versant 20 millilitres de solution d’EDTA de trypsine fraîche pour fusionner les complexes de sclérotique choroïde RPE. Placez le plat dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant près de 30 minutes.Après 30 minutes, sortez la capsule de l’incubateur et ajoutez 20 millilitres de milieux de culture cellulaire préchaudes avec 10% FBS dans la boîte. Pour neutraliser les déclenchements en solution d’EDTA, utilisez une pipette de transfert de cinq millilitres pour dissocier les cellules EPR en pipetant doucement plusieurs fois. Recueillir les suspensions cellulaires dans des tubes centrifuges de 15 millilitres, puis pipeter doucement 10 millilitres supplémentaires de milieux de culture frais avec FBS pour laver les complexes de sclérotique RPE Choroids sur le plat.Recueillir les cellules EPR en centrifugeant les tubes à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le SuperAgent à l’aide d’une pipette et ajouter cinq millilitres supplémentaires de milieux de culture avec FBS pour remettre les cellules en suspension. Centrifuger à 300 G pendant encore cinq minutes.Décanter le SuperAgent et remettre les cellules en suspension avec 12 millilitres de milieux de culture. Prochaine graine de 100 000 à 200 000 cellules par puits dans 12 plaques de culture de puits ou inserts transwell. Changez les milieux de culture tous les deux jours et réduisez la concentration sérique à 1% lorsque les cellules couvrent complètement la surface des puits par insert.Changez les milieux de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient récoltées. Les images représentatives des cellules EPR porcines primaires du deuxième jour, du sixième jour et du jour 10 sont présentées ici. L’analyse QRTPCR des niveaux d’ARNm des gènes de signature dans les cellules RPE porcines primaires, les cellules RPE humaines primaires, les cellules ARPE 19 et le tissu choroïde RPE porcin est détectée par cette image graphique.Ici, GAP DH a été utilisé comme gène d’entretien pour RTPCR. Quatre réplicas biologiques ont été utilisés pour les cellules EPR porcines primaires et une cellule EPR 19 où trois réplicas biologiques ont été utilisés pour les cellules EPR humaines primaires et le tissu choroïde EPR porcin. Les niveaux d’expression génique dans les cellules ARPE 19 ont été définis comme témoins.L’analyse sanguine occidentale des protéines RPE 65 dans les cellules ARPE 19 et porcines RPE et dans les cellules RPE humaines primaires et les tissus choroïdes RPE porcins est illustrée dans cette figure. Le vinculin était utilisé ici comme contrôle de chargement. Cette figure montre une culture de deux semaines de cellules EPR porcines dans un milieu DMEM Basic avec 1% FBS.Les cellules cultivées avec ou sans Lamin ont été colorées avec RPE 65, APTA sodium-potassium, Z01 et Hex. Les mesures TR dans des feuilles cellulaires, cultivées avec ou sans laminine sont représentées dans cette figure. L’analyse sanguine occidentale du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire ou VEGF et du facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire ou PEDF dans les cellules RPE porcines primaires et ARPE 19 est illustrée dans cette figure.Les fonctions sectorielles des cellules RPE porcines primaires en culture et ARPE 19 sont présentées dans ces images. La grande partie de ce protocole consiste à dissoudre les cellules RP des complexes gliaux chides RPE. Nous recommandons d’utiliser des voyages frais et une solution à chaque fois et de contrôler correctement le temps de digestion, pour dissoudre huit cellules RP.

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