Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
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Die Autoren möchten allen Tieren, die ihre Zellen in diese Studie einbringen, ihre Dankbarkeit und ihren Respekt entgegenbringen. Diese Studie wurde zum Teil durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao und Grant No. 2018YFA0107301, Wei Li) unterstützt. Die Autoren danken Jingru Huang und Xiang You vom Central Lab, School of Medicine, Xiamen University für die technische Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung.

Die Verwendung von Versuchstieren entsprach den Vorschriften der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) und wurde von der Ethikkommission für experimentelles Tiermanagement der Universität Xiamen genehmigt.
1. Herstellung von experimentellen chirurgischen Geräten, Gewebeverdauungsenzym und Zellkulturpuffer
<ol><li>Bereiten Sie die experimentellen chirurgischen Geräte vor, indem Sie am Tag vor der Augapfeldissektion zwei Paar ophthalmochirurgische Sch...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

Hier wurde ein detailliertes und optimiertes Protokoll für die Isolierung, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen aus Augäpfeln von Schweinen beschrieben, das ein gutes Modell für die In-vitro-Charakterisierung von RPE-Zellen und RPE-bezogene Störungsstudien erzeugt. Methoden zur Isolierung des RPE aus den Augen von Menschen, Mäusen und Ratten wurden bereitsbeschrieben 23,24,25. In einigen Laboratorien ist es ...

Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich zwischen Photorezeptoren und Choriokapillaris in der äußeren Schicht der Netzhaut1 und hat mehrere Funktionen, einschließlich der Bildung der Blut-Retina-Schranke, des Transports und Austauschs von Nährstoffen und retinalen Metaboliten, des Recyclings von Vitamin A zur Aufrechterhaltung eines normalen Sehzyklus sowie der Phagozytose und Beseitigung der abgestoßenen äußeren Photorezeptorsegmente (POSs)2,3 . Da POSs eine ständige Selbsterneuerung erfordern, um das Sehen zu erzeugen, müssen die RPE-Zellen kontinuierlich abgelöste POSs verschlingen, um die retinale Homöostaseaufrechtzuerhalten 4. Daher führt eine RPE-Dysfunktion zu vielen erblindenden Augenerkrankungen, wie z.B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD)4, Retinitis pigmentosa (RP)5, Lebersche kongenitale Amaurose6, diabetische Retinopathie7 usw. Bis heute ist die genaue Pathogenese der meisten dieser Krankheiten schwer fassbar. Infolgedessen wird die RPE-Zellkultur etabliert, um die RPE-Zellbiologie, pathologische Veränderungen und zugrunde liegende Mechanismen zu untersuchen.
Als einfachstes Modell zur Untersuchung der Zellbiologie wurde bereits in den 1920er Jahren mit der Kultivierung von RPE-Zellen begonnen8. Obwohl ARPE-19 als RPE-Zellen weit verbreitet ist, geben der Verlust der Pigmentierung, die Morphologie des Kopfsteinpflasters und insbesondere die Barrierefunktionen in dieser Zelllinie Anlass zur Sorge9. Im Vergleich dazu bietet die Kultur primärer humaner RPE-Zellen ein realistischeres Szenario für physiologische und pathologische Studien9. Die relativ begrenzte Verfügbarkeit schränkt jedoch ihre Nutzung ein und es gibt immer ethische Fragen. Darüber hinaus verwendeten mehrere Gruppen Mausmodelle, um RPE-Zellen zu kultivieren. Die Größe des Mausauges ist jedoch klein, und eine einzelne Kultur erfordert normalerweise viele Mäuse, was nicht praktisch ist9. In jüngster Zeit haben Wissenschaftler neue Methoden entwickelt, um menschliche embryonale Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen zur Gewinnung von RPE-Zellen zu verwenden. Obwohl diese Technik ein besonderes Potenzial für die Behandlung von erblichen RPE-Störungen hat, ist sie zeitaufwendig und benötigt in der Regel mehrere Monate, um reife RPE-Zellen zu erzeugen10. Um diese Probleme zu überwinden, stellen wir hier ein einfach zu befolgendes Protokoll vor, um hochreine RPE-Zellen routinemäßig im Labor zu isolieren und zu kultivieren. Unter geeigneten Kulturbedingungen können diese Zellen typische RPE-Funktionen aufweisen und typische RPE-Morphologien aufweisen. Daher kann diese Kulturmethode ein gutes Modell liefern, um die RPE-Physiologie zu verstehen, die Zytotoxizität zu untersuchen, pathologische Mechanismen verwandter Augenerkrankungen zu untersuchen und Medikamentenscreenings durchzuführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus polarisierten pigmentierten Epithelzellen, die sich zwischen Aderhaut und Neuroretina in der Netzhaut befindet. Mehrere Funktionen, einschließlich Phagozytose, Nährstoff- / Metabolitentransport, Vitamin-A-Stoffwechsel usw., werden vom RPE täglich durchgeführt. RPE-Zellen sind terminale differenzierte Epithelzellen mit geringer oder keiner Regenerationsfähigkeit. Der Verlust von RPE-Zellen führt zu mehreren Augenerkrankungen, die zu Sehstörungen führen, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration. Daher ist die Etablierung eines In-vitro-Kulturmodells von primären RPE-Zellen, das dem RPE in vivo ähnlicher ist als Zelllinien, entscheidend für die charakteristischen und mechanistischen Untersuchungen von RPE-Zellen. In Anbetracht der Tatsache, dass die Quelle menschlicher Augäpfel begrenzt ist, erstellen wir ein Protokoll zur Kultivierung primärer porciner RPE-Zellen. Durch die Verwendung dieses Protokolls können RPE-Zellen leicht von erwachsenen Augäpfeln von Schweinen getrennt werden. Anschließend heften sich diese dissoziierten Zellen an Kulturschalen / -inserts, vermehren sich zu einer konfluenten Monoschicht und stellen die Schlüsselmerkmale des Epithelgewebes in vivo innerhalb von 2 Wochen schnell wieder her. Mittels qRT-PCR wird gezeigt, dass primäre porcine RPE-Zellen mehrere Signaturgene in vergleichbaren Konzentrationen mit nativem RPE-Gewebe exprimieren, während die Expression der meisten dieser Gene in menschlichen RPE-ähnlichen Zellen, ARPE-19, verloren geht bzw. stark reduziert ist. Darüber hinaus zeigt die Immunfluoreszenzfärbung die Verteilung von Tight Junction-, Gewebepolaritäts- und Zytoskelettproteinen sowie das Vorhandensein von RPE65, einer Isomerase, die für den Vitamin-A-Stoffwechsel entscheidend ist, in kultivierten Primärzellen. Insgesamt haben wir einen einfach zu befolgenden Ansatz entwickelt, um primäre porcine RPE-Zellen mit hoher Reinheit und nativen RPE-Eigenschaften zu kultivieren, der als gutes Modell dienen könnte, um die RPE-Physiologie zu verstehen, Zelltoxizitäten zu untersuchen und Medikamentenscreenings zu erleichtern.

Die primären porcinen RPE-Zellen (pRPE) wurden in DMEM/Basismedien mit 10% FBS kultiviert, und die Zellmorphologie unter dem Lichtmikroskop wurde 2 Tage (Abbildung 2A), 6 Tage (Abbildung 2B) und 10 Tage (Abbildung 2C) nach der Aussaat fotografiert. Nach 1 Woche wurde eine konfluente Monoschicht von pigmentierten pRPE-Zellen mit Kopfsteinpflaster-Morphologien beobachtet.
Um die primären pRPE-Zellen besse...

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Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Hier wird eine einfach zu befolgende Methode zur Kultivierung primärer retinaler Netzhaut-Pigmentepithelzellen in vitro vorgestellt.

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

RPE-assoziierte Störungen sind nach wie vor ein wichtiger Teil der Vermischung von Krankheiten, jedoch ohne wirksame Überreste in der virtuellen Kultur von primären RPE-Zellen, die als gutes Modell für physiologische und pathologische Studien von RPE-assoziierten Störungen dienen könnten. In diesem Protokoll stellen wir ein einfach zu befolgendes Protokoll zur Kultivierung primärer IPCs zur Verfügung, das spätere RP-Eigenschaften schnell wiederherstellen und aufrechterhalten könnte. Wir glauben, dass Menschen mit dieser Methode schnell RP-Zellen aus Makistat-Studien und den schützenden Medikamenten-Screenings erzeugen könnten, die die Entwicklung neuer Behandlungen für RPE-Störungen erleichtern könnten. Eine Schritt-für-Schritt-Demonstration des Wertes wird es viel einfacher machen, diese Methode in verschiedenen Laboratorien zu replizieren, die RP-Zellen untersuchen möchten.Um zu beginnen, tauen Sie das Gewebeverdauungsenzym Malaquad auf und sterilisieren Sie 1X PBS. Ergänzt mit 2 % Penicillin und 2 % Streptomycin durch Filtration der Lösung durch eine 0,22 Mikrometer Spritzenfiltereinheit. Waschen Sie die Vertiefungen der Kulturplatte und der Transwell-Einsätze mit 1X PBS.Entfernen Sie das PBS mit einer Pipette aus den Vertiefungen und Transwells und geben Sie einen Milliliter frisches 1X PBS in die untere Kammer und 600 Mikroliter 10 Mikrogramm pro Milliliter Lamininlösung in die obere Kammer. Inkubieren Sie die Platten und Transwell-Einsätze in diesem Heliciculture-Inkubator über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Danach entfernen Sie die Laminatlösung aus der oberen Kammer und waschen Sie zweimal mit einem Milliliter kaltem 1X PBS, bevor Sie die Zelle einsetzen. Reinigen Sie die Laminat-Flow-Haube mit 75% Ethanol und UV-Licht.Bereiten Sie drei sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit etwa 25 Millilitern 75%igem Ethanol, drei sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit etwa 25 Millilitern 1X PBS und drei 10-cm-sterile Zellkulturschalen mit etwa 15 Millilitern 1X PBS vor. Weichen Sie vier Schweineaugäpfel in etwa 15 Milliliter 75% Ethanol in einer 10 Zentimeter großen Petrischale ein und schneiden Sie mit einer Schere und einer Pinzette das restliche Bindegewebe und die Muskeln ab. Um die Augäpfel zu dekontaminieren, tränken und waschen Sie vier Augäpfel in drei sterilen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, die nacheinander mit 75% Ethanol gefüllt sind.Waschen Sie dann die Augäpfel nacheinander in drei sterilen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, die mit 1X PBS gefüllt sind. Drehen Sie die Schläuche jede Minute um, um die Augäpfel gründlich zu waschen. Bewegen Sie die vier Augäpfel in eine 10 Zentimeter große sterile Zellkulturschale mit 1X PBS.Schneiden Sie die äußere Oberfläche jedes Augapfels erneut ab, um den Sehnerv und kleine Trümmer zu entfernen. Verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt am Schnittpunkt von Limbus und Sklera zu machen. Und dann entfernen Sie die Hornhaut, die Iris, die Linse, den Glaskörper und die neurale Netzhaut.Übertragen Sie den RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex in eine neue 10-Zentimeter-Zellkulturschale und machen Sie vier Schnitte, um die Augenmuschel in die Form eines vierblättrigen Kleeblatts zu glätten. Führen Sie Ausflüge in die Verdauung von EDTA-Lösungen durch, indem Sie die vier RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe in eine neue 10-Zentimeter-Schale geben und 20 Milliliter frische Trypsin-EDTA-Lösung gießen, um die RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe zu verschmelzen. Stellen Sie die Schale für fast 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Nach 30 Minuten nehmen Sie die Schale aus dem Inkubator und geben Sie 20 Milliliter vorwarme Zellkulturmedien mit 10% FBS in die Schale. Um die Trips in der EDTA-Lösung zu neutralisieren, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Transferpipette, um die RPE-Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals zu dissoziieren. Sammeln Sie die Zellsuspensionen in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie dann vorsichtig weitere 10 Milliliter frisches Nährmedium mit FBS, um die RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe auf der Schale zu waschen.Sammeln Sie die RPE-Zellen, indem Sie die Röhrchen bei 300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie den SuperAgent mit einer Pipette ab und fügen Sie weitere fünf Milliliter Nährmedien mit FBS hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Zentrifuge bei 300 g für weitere fünf Minuten.Dekantieren Sie den SuperAgent und suspendieren Sie die Zellen mit 12 Milliliter Nährmedien. Als nächstes werden 100.000 bis 200.000 Zellen pro Vertiefung in 12 Well-Kulturplatten oder Transwell-Einsätze gesät. Wechseln Sie die Nährmedien alle zwei Tage und reduzieren Sie die Serumkonzentration auf 1%, wenn die Zellen die Oberfläche der Vertiefungen pro Einsatz vollständig bedecken.Wechseln Sie die Nährmedien alle zwei Tage, bis die Zellen geerntet sind. Die repräsentativen Bilder der primären porcinen RPE-Zellen am zweiten, sechsten und 10. Tag sind hier zu sehen. Die QRTPCR-Analyse der mRNA-Spiegel von Signaturgenen in primären porcinen RPE-Zellen, primären humanen RPE-Zellen, ARPE-19-Zellen und porcinem RPE-Aderhautgewebe wird durch dieses grafische Bild detektiert.Hier wurde GAP DH als Housekeeping-Gen für RTPCR verwendet. Vier biologische Replikate wurden für primäre porcine RPE-Zellen und eine RPE 19-Zelle verwendet, während drei biologische Replikate für primäre humane RPE-Zellen und porcines RPE-Aderhautgewebe verwendet wurden. Die Genexpressionsniveaus in ARPE-19-Zellen wurden als Kontrollen festgelegt.Die westliche Blutanalyse von RPE-65-Proteinen in ARPE-19- und porcinen RPE-Zellen sowie in primären humanen RPE-Zellen und porcinen RPE-Aderhautgeweben ist in dieser Abbildung dargestellt. Vinculin wurde hier als Belastungskontrolle eingesetzt. Diese Abbildung zeigt eine zweiwöchige Kultur von porcinen RPE-Zellen in DMEM-Basic-Medien mit 1%FBS.Zellen, die mit oder ohne Lamin kultiviert wurden, wurden mit RPE 65, Natrium-Kalium-APTAs, Z01 und Hex gefärbt. TR-Messungen in Zellblättern, die mit oder ohne Laminin kultiviert wurden, sind in dieser Abbildung dargestellt. Die westliche Blutanalyse des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) und des Pigmentepithel-abgeleiteten Faktors (PEDF) in primären porcinen RPE- und ARPE-19-Zellen ist in dieser Abbildung dargestellt.In diesen Bildern werden die sektoralen Funktionen von kultivierten primären porcinen RPE- und ARPE-19-Zellen dargestellt. Der größte Teil dieses Protokolls besteht darin, RP-Zellen aus RPE-Chide-Glia-Komplexen aufzulösen. Wir empfehlen, jedes Mal frische Trips und Lösungen zu verwenden und die Verdauungszeit richtig zu kontrollieren, um acht RP-Zellen aufzulösen.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Forschung

Biologie

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimale Lentivirus Produktion und Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche transduzieren primären humanen bronchialen Epithelzellen

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...