Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

המחברים רוצים להראות את הכרת התודה והכבוד שלהם לכל בעלי החיים שתורמים את התאים שלהם במחקר זה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים מתוכנית המו"פ הלאומית של סין (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao ומענק מס' 2018YFA0107301, Wei Li). המחברים מודים לג'ינגרו הואנג ושיאנג יו מהמעבדה המרכזית, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת שיאמן על התמיכה הטכנית בהדמיה קונפוקלית.

השימוש בחיות ניסוי עמד בתקנות האגודה למחקר בראייה וברפואת עיניים (ARVO) ואושר על ידי ועדת האתיקה לניהול ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת שיאמן.
1. הכנת מכשירים כירורגיים ניסיוניים, אנזים לעיכול רקמות וחיץ תרביות תאים
<ol><li>הכינו את המכשירים הכירורגיים הניסיוניים, על י?...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

כאן תואר פרוטוקול מפורט וממוטב לבידוד, תרבית ואפיון של תאי RPE מגלגלי עיניים חזיריים, המייצר מודל טוב לאפיון חוץ גופי של תאי RPE ומחקרי הפרעות הקשורות ל-RPE. שיטות לבידוד ה-RPE מעיני אדם, עכבר וחולדה תוארו בעבר23,24,25. עם זאת, קשה להשיג גלגלי עי...

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) ממוקם בין פוטורצפטורים וכוריוקפילריס בשכבה החיצונית של הרשתית1 עם פונקציות מרובות, כולל יצירת מחסום הדם-רשתית, הובלה והחלפה של חומרים מזינים ומטבוליטים ברשתית, מיחזור ויטמין A כדי לשמור על מחזור ראייה תקין, ופאגוציטוזה ופינוי של מקטעים חיצוניים של פוטורצפטור (POSs)2,3 . מכיוון שנקודות תורפה דורשות התחדשות עצמית מתמדת כדי ליצור ראייה, תאי ה-RPE צריכים לבלוע ברציפות נקודות מכירה מנותקות כדי לשמור על הומאוסטזיס רשתית4. לכן, תפקוד לקוי של RPE גורם למחלות עיניים מסנוורות רבות, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD)4, רטיניטיס פיגמנטוזה (RP)5, אמורוזיס מולד לבר6, רטינופתיה סוכרתית7 וכו '. עד כה, הפתוגנזה המדויקת של רוב המחלות הללו נותרה חמקמקה. כתוצאה מכך, תרבית תאי RPE הוקמה כדי לחקור ביולוגיה של תאי RPE, שינויים פתולוגיים ומנגנונים בסיסיים.
כמודל הפשוט ביותר לחקר הביולוגיה של התא, התרבית של תאי RPE החלה כבר בשנותה-20 של המאה ה-20. למרות ש-ARPE-19 נמצא בשימוש נרחב כתאי RPE, אובדן פיגמנטציה, מורפולוגיה מרוצפת, ובמיוחד תפקודי המחסום בקו תאים זה מעלים חששות רבים9. לשם השוואה, התרבית של תאי RPE אנושיים ראשוניים מציעה תרחיש מציאותי יותר למחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים9. עם זאת, הזמינות המוגבלת יחסית מגבילה את השימוש בהם וסוגיות אתיות קיימות תמיד. בנוסף, מספר קבוצות השתמשו במודלים של עכברים כדי לתרבת תאי RPE. עם זאת, גודל עין העכבר הוא קטן, ותרבות אחת בדרך כלל דורש עכברים רבים, וזה לא נוח9. לאחרונה, מדענים פיתחו שיטות חדשות לשימוש בתאי גזע עובריים אנושיים או בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כדי להפיק תאי RPE. למרות שלטכניקה זו יש פוטנציאל מיוחד לטיפול בהפרעות RPE תורשתיות, היא גוזלת זמן ובדרך כלל דורשת מספר חודשים כדי ליצור תאי RPE בוגרים10. כדי להתגבר על בעיות אלה, כאן אנו מציגים פרוטוקול קל למעקב כדי לבודד ולתרבת תאי RPE בטוהר גבוה במעבדה באופן שגרתי. בתנאי תרבית מתאימים, תאים אלה יכולים להציג פונקציות RPE אופייניות ולהציג מורפולוגיות RPE טיפוסיות. לכן, שיטת תרבות זו יכולה לספק מודל טוב להבנת הפיזיולוגיה של RPE, לחקור ציטוטוקסיות, לחקור מנגנונים פתולוגיים של מחלות עיניים קשורות ולבצע בדיקות סמים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי של תאי אפיתל פיגמנטיים מקוטבים, הממוקמים בין הכורואיד לנוירוארטינה ברשתית. פונקציות מרובות, כולל פאגוציטוזיס, הובלת חומרים מזינים / מטבוליטים, מטבוליזם של ויטמין A וכו ', מבוצעות על ידי RPE על בסיס יומי. תאי RPE הם תאי אפיתל ממוינים עם יכולת התחדשות מועטה או ללא יכולת התחדשות. אובדן תאי RPE גורם למחלות עיניים מרובות המובילות לליקוי ראייה, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל. לכן, הקמת מודל תרבית במבחנה של תאי RPE ראשוניים, הדומה יותר ל-RPE in vivo מאשר לקווי תאים, היא קריטית למחקרים האופייניים והמכניסטיים של תאי RPE. בהתחשב בעובדה שמקור גלגלי העיניים האנושיים מוגבל, אנו יוצרים פרוטוקול לתרבית תאי RPE חזיריים ראשוניים. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, ניתן לנתק בקלות תאי RPE מגלגלי עיניים חזיריים בוגרים. לאחר מכן, תאים מנותקים אלה מתחברים לתרביות/תוספות, מתרבים ליצירת מונו-שכבה מתמזגת, ומבססים מחדש במהירות תכונות מרכזיות של רקמת אפיתל in vivo תוך 2 שבועות. על ידי qRT-PCR, הוכח כי תאי RPE חזיריים ראשוניים מבטאים גנים חתימה מרובים ברמות דומות לרקמת RPE מקורית, בעוד שהביטויים של רוב הגנים הללו הולכים לאיבוד/מופחתים מאוד בתאים דמויי RPE אנושיים, ARPE-19. יתר על כן, צביעת האימונופלואורסצנציה מראה את התפלגות הצומת ההדוק, קוטביות הרקמה וחלבוני השלד, כמו גם את נוכחותו של RPE65, איזומראז חיוני לחילוף החומרים של ויטמין A, בתאים ראשוניים בתרבית. בסך הכל, פיתחנו גישה קלה למעקב לתרבית תאי RPE חזיריים ראשוניים עם טוהר גבוה ותכונות RPE מקוריות, שיכולה לשמש מודל טוב להבנת הפיזיולוגיה של RPE, לחקר רעילות תאים ולהקלה על בדיקות סמים.

תאי ה-RPE החזיריים העיקריים (pRPE) גודלו בתרבית במדיה DMEM/Basic עם 10% FBS, והמורפולוגיה של התאים תחת מיקרוסקופ אור צולמה ביומיים (איור 2A), 6 ימים (איור 2B) ו-10 ימים (איור 2C) לאחר הזריעה. לאחר 1 שבועות, נצפתה שכבה חד-שכבתית משולבת של תאי pRPE פיגמנטיים עם מורפול...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

כאן מוצגת שיטה קלה למעקב לתרבית תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזיריים ראשוניים במבחנה .

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

הפרעות הקשורות ל-RPE נשארות חלק מרכזי במיזוג מחלות, אך ללא שרידים יעילים בתרבית וירטואלית של תאי RPE ראשוניים שישמשו מודל טוב למחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים של הפרעות הקשורות ל-RPE. בפרוטוקול זה, אנו מספקים פרוטוקול קל למעקב לתרבית IPCs ראשוניים, אשר יכול לשחזר במהירות ולשמור על מאפייני RP מאוחרים יותר, אנו מאמינים כי באמצעות שיטה זו אנשים יכולים ליצור במהירות תאי RP ממחקרי macistate ואת הקרנות סמים מגן אשר יכול להקל על פיתוח של טיפול חדש עבור הפרעות RPE. הדגמת ערך צעד אחר צעד תהפוך את השיטה הזו להרבה יותר קלה לשכפול במעבדות שונות שרוצות לחקור תאי RP.כדי להתחיל להפשיר את אנזים עיכול רקמות malaquad ולעקר 1X PBS. בתוספת 2% פניצילין ו-2% סטרפטומיצין על ידי סינון התמיסה דרך יחידת מסנן מזרק בגודל 0.22 מיקרומטר. לשטוף את הבארות של צלחת תרבית ו transwell מוסיף עם 1X PBS.הסר את PBS מן הבארות ו transwells עם פיפטה ולהוסיף מיליליטר אחד של 1X PBS טרי לתא התחתון ו 600 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם לכל מיליליטר תמיסת למינין לתא העליון. דגירה של הצלחות ותוספות טרנסוול בחממת הליציקולטורה זו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הסר את תמיסת הלמינציה מהתא העליון ושטוף במיליליטר אחד של PBS קר 1X פעמיים לפני שיושבת התא נקה את מכסה המנוע של זרימת הלמינציה עם 75% אתנול ואור UV.הכינו שלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מיליליטר המכילים כ-25 מיליליטר של 75% אתנול, שלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מיליליטר המכילים כ-25 מיליליטר של 1X PBS, ושלושה כלי תרבית תאים סטריליים באורך 10 ס"מ המכילים כ-15 מיליליטר של 1X PBS. השרו ארבעה גלגלי עיניים חזיריים בכ-15 מיליליטר של 75% אתנול בצלחת פטרי באורך 10 ס"מ והשתמשו בזוג מספריים ומלקחיים כדי לנתק את כל שאריות רקמות החיבור והשרירים. כדי לפרק את גלגלי העיניים, השרו ושטפו ארבעה גלגלי עיניים בשלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מיליליטר מלאים ב-75% אתנול ברצף.לאחר מכן לשטוף את גלגלי העיניים בשלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מיליליטר מלא 1X PBS ברצף. הפוך את הצינורות כל דקה כדי לשטוף את גלגלי העיניים ביסודיות. העבירו את ארבעת גלגלי העיניים לתוך צלחת תרבית תאים סטרילית באורך 10 ס"מ המכילה PBS 1X.חתוך שוב את המשטח החיצוני של כל גלגל עיניים, כדי להסיר את עצב הראייה ופסולת קטנה. השתמש מספריים כדי לעשות חתך קטן בצומת של לימבוס וסקלרה. ואז להסיר את הקרנית, הקשתית, העדשה, הגוף הזגוגי והרשתית העצבית.העבירו את קומפלקס ה-RPE choroid sclera לצלחת תרבית תאים חדשה באורך 10 ס"מ ובצעו ארבעה חיתוכים כדי לנפח את העין לצורת תלתן בעל ארבעה עלים. בצע מסעות בעיכול תמיסות EDTA על ידי הצבת ארבעת מתחמי הסקלרה של RPE choroid לתוך צלחת חדשה בגודל 10 ס"מ ומזיגת 20 מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA טרייה כדי למזג את קומפלקסי הסקלרה הכורואידים של RPE. מכניסים את המנה לחממה של תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כמעט 30 דקות.לאחר 30 דקות, מוציאים את המנה מהאינקובטור ומוסיפים 20 מיליליטר של מדיה של תרבית תאים חמה מראש עם 10% FBS למנה. כדי לנטרל את הנסיעות בתמיסת EDTA השתמש פיפטה העברה של חמישה מיליליטר כדי לנתק את תאי ה- RPE על ידי פיפטינג עדין מספר פעמים. לאסוף את מתלי התא לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר, ולאחר מכן בעדינות פיפטה עוד 10 מיליליטר של מדיה תרבית טרי עם FBS לשטוף את RPE Choroids sclera קומפלקסים על המנה.אסוף את תאי ה-RPE על ידי צנטריפוגה של הצינורות ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את ה-SuperAgent באמצעות פיפטה והוסיפו עוד חמישה מיליליטרים של מדיית תרבית עם FBS כדי להשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה ב 300 גרם במשך חמש דקות נוספות.לנטרל את SuperAgent ולהשעות מחדש את התאים עם 12 מיליליטר של מדיה תרבית. הזרע הבא 100, 000 עד 200, 000 תאים לכל באר לתוך 12 צלחות תרבית באר או טרנסוול מוסיף. שנה את מדיית התרבית כל יומיים והפחת את ריכוז הסרום ל -1% כאשר התאים מכסים באופן מלא את פני השטח של הבארות בכל תוספת.שנה את מדיית התרבית כל יומיים עד שהתאים נקטפים. התמונות המייצגות של תאי RPE חזיריים ראשוניים ביום השני, ביום השישי וביום העשירי מוצגות כאן. ניתוח QRTPCR של רמות mRNA של גנים חתימה בתאי RPE חזיריים ראשוניים, תאי RPE אנושיים ראשוניים, תאי ARPE 19 ורקמת כורואיד RPE חזירית מזוהה על ידי תמונה גרפית זו.כאן GAP DH שימש כגן משק הבית עבור RTPCR. ארבעה שכפולים ביולוגיים שימשו לתאי RPE חזיריים ראשוניים ולתאי RPE 19 שבהם שלושה שכפולים ביולוגיים שימשו לתאי RPE אנושיים ראשוניים ולרקמת כורואיד RPE חזירית. רמות ביטוי הגנים בתאי ARPE 19 הוגדרו כבקרות.ניתוח הדם המערבי של חלבוני RPE 65 בתאי ARPE 19 ו-RPE חזיריים ובתאי RPE אנושיים ראשוניים וברקמות כורואידיות של RPE חזירי מוצגים באיור זה. וינקולין שימש כאן כבקרת טעינה. נתון זה מציג תרבית של שבועיים של תאי RPE חזיריים במדיה DMEM Basic עם 1% FBS.תאים בתרבית עם או בלי לאמין הוכתמו ב-RPE 65, נתרן אשלגן APTAs, Z01 והקס. מדידות TR ביריעות תאים, בתרבית עם או בלי למינין מתוארות באיור זה. ניתוח הדם המערבי של גורם גדילה אנדותל וסקולרי או VEGF וגורם אפיתל פיגמנטי נגזר או PEDF בתאי RPE חזיריים ראשוניים ו- ARPE 19 מוצגים באיור זה.הפונקציות הסקטוריאליות של תאי RPE חזיריים ראשוניים בתרבית ותאי ARPE 19 מוצגות בתמונות אלה. החלק הגדול של פרוטוקול זה הוא להמיס תאי RP ממתחמי גליה של RPE chide. אנו ממליצים להשתמש בנסיעות ותמיסות טריות בכל פעם ולשלוט כראוי בזמן העיכול, כדי להמיס שמונה תאי RP.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

אופטימלית Lentivirus ייצור תרבית תאי תנאים הכרחיים בהצלחת transduce האדם הראשי תאי אפיתל סימפונות

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...