Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
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Gli autori vorrebbero mostrare la loro gratitudine e rispetto a tutti gli animali che contribuiscono con le loro cellule in questo studio. Questo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao e Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Gli autori ringraziano Jingru Huang e Xiang You del Central Lab, School of Medicine, Xiamen University per il supporto tecnico nell'imaging confocale.

L'uso di animali da esperimento è conforme ai regolamenti dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) ed è stato approvato dal Comitato etico di gestione animale sperimentale dell'Università di Xiamen.
1. Preparazione di dispositivi chirurgici sperimentali, enzima di digestione tissutale e tampone di coltura cellulare
<ol><li>Preparare i dispositivi chirurgici sperimentali, pulendo e autoclavando due paia di forbici chirurgiche oftalmiche e pinze il ...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

Qui, è stato descritto un protocollo dettagliato e ottimizzato per l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione di cellule RPE da bulbi oculari suini, che genera un buon modello per la caratterizzazione in vitro delle cellule RPE e studi sui disturbi correlati a RPE. I metodi per l'isolamento dell'RPE dagli occhi umani, di topo e di ratto sono stati descritti in precedenza23,24,25. Tuttavia, è difficile ottenere bu...

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova tra i fotorecettori e i coriocapillari nello strato esterno della retina1 con molteplici funzioni, tra cui la formazione della barriera emato-retinica, il trasporto e lo scambio di nutrienti e metaboliti della retina, il riciclaggio della vitamina A per mantenere un normale ciclo visivo e la fagocitosi e la clearance dei segmenti esterni dei fotorecettori (POS)2,3 . Poiché i POS richiedono un costante auto-rinnovamento per generare la visione, le cellule RPE devono continuamente inghiottire i POS distaccati per mantenere l'omeostasi retinica4. Pertanto, la disfunzione RPE provoca molte malattie dell'occhio accecante, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD)4, la retinite pigmentosa (RP)5, l'amaurosi congenita di Leber6, la retinopatia diabetica7, ecc. Fino ad ora, l'esatta patogenesi della maggior parte di queste malattie rimane elusiva. Di conseguenza, la coltura cellulare RPE viene stabilita per studiare la biologia cellulare RPE, i cambiamenti patologici e i meccanismi sottostanti.
Come modello più semplice per studiare la biologia cellulare, la coltura delle cellule RPE è stata avviata già nel 19208. Sebbene ARPE-19 sia ampiamente utilizzato come cellule RPE, la perdita di pigmentazione, la morfologia del ciottolo e, soprattutto, le funzioni di barriera in questa linea cellulare sollevano molte preoccupazioni9. In confronto, la coltura di cellule RPE umane primarie offre uno scenario più realistico per studi fisiologici e patologici9. Tuttavia, la disponibilità relativamente limitata ne limita l'uso e le questioni etiche esistono sempre. Inoltre, diversi gruppi hanno utilizzato modelli murini per la coltura di celle RPE. Tuttavia, la dimensione dell'occhio del topo è piccola e una singola coltura di solito richiede molti topi, il che non è conveniente9. Recentemente, gli scienziati hanno sviluppato nuovi metodi per utilizzare cellule staminali embrionali umane o cellule staminali pluripotenti indotte per derivare cellule RPE. Sebbene questa tecnica abbia un particolare potenziale per il trattamento dei disturbi ereditari di RPE, richiede molto tempo e di solito richiede diversi mesi per generare cellule RPE mature10. Per superare questi problemi, qui introduciamo un protocollo facile da seguire per isolare e coltivare regolarmente cellule RPE ad alta purezza in laboratorio. In condizioni di coltura adeguate, queste cellule possono mostrare funzioni RPE tipiche e mostrare morfologie RPE tipiche. Pertanto, questo metodo di coltura può fornire un buon modello per comprendere la fisiologia RPE, studiare la citotossicità, indagare sui meccanismi patologici delle malattie oculari correlate e condurre screening farmacologici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule epiteliali pigmentate polarizzate, situato tra la coroide e la neuroretina nella retina. Molteplici funzioni, tra cui la fagocitosi, il trasporto di nutrienti / metaboliti, il metabolismo della vitamina A, ecc., Sono condotte dall'RPE su base giornaliera. Le cellule RPE sono cellule epiteliali differenziate terminalmente con poca o nessuna capacità rigenerativa. La perdita di cellule RPE provoca molteplici malattie degli occhi che portano a disabilità visive, come la degenerazione maculare legata all'età. Pertanto, la creazione di un modello di coltura in vitro di cellule RPE primarie, che assomiglia più da vicino all'RPE in vivo rispetto alle linee cellulari, è fondamentale per gli studi caratteristici e meccanicistici delle cellule RPE. Considerando il fatto che la fonte dei bulbi oculari umani è limitata, creiamo un protocollo per la coltura di cellule RPE primarie suine. Utilizzando questo protocollo, le cellule RPE possono essere facilmente dissociate dai bulbi oculari suini adulti. Successivamente, queste cellule dissociate si attaccano a piatti/inserti di coltura, proliferano per formare un monostrato confluente e ristabiliscono rapidamente le caratteristiche chiave del tessuto epiteliale in vivo entro 2 settimane. Con la qRT-PCR, è dimostrato che le cellule RPE primarie suine esprimono più geni firma a livelli comparabili con il tessuto RPE nativo, mentre le espressioni della maggior parte di questi geni sono perse / altamente ridotte nelle cellule umane simili a RPE, ARPE-19. Inoltre, la colorazione con immunofluorescenza mostra la distribuzione delle proteine della giunzione stretta, della polarità tissutale e del citoscheletro, nonché la presenza di RPE65, un'isomerasi fondamentale per il metabolismo della vitamina A, nelle cellule primarie in coltura. Nel complesso, abbiamo sviluppato un approccio facile da seguire alla coltura di cellule RPE primarie suine con elevata purezza e caratteristiche RPE native, che potrebbe servire come un buon modello per comprendere la fisiologia dell'RPE, studiare la tossicità cellulare e facilitare gli screening farmacologici.

Le cellule RPE primarie suine (pRPE) sono state coltivate in terreni DMEM / Basic con il 10% di FBS e la morfologia cellulare al microscopio ottico è stata fotografata a 2 giorni (Figura 2A), 6 giorni (Figura 2B) e 10 giorni (Figura 2C) dopo la semina. Dopo 1 settimana, è stato osservato un monostrato confluente di cellule pRPE pigmentate con morfologie di ciottoli.
Per caratterizzare meglio le cellule ...

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Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Qui viene presentato un metodo facile da seguire per la coltura in vitro di cellule epiteliali primarie del pigmento retinico suino.

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

I disturbi correlati all'RPE rimangono una parte importante della miscelazione delle malattie, ma senza resti efficaci nella coltura virtuale di cellule RPE primarie che servano da buon modello per studi fisiologici e patologici sui disturbi correlati all'RPE. In questo protocollo, forniamo un protocollo facile da seguire per la coltura di IPC primari, che potrebbe rapidamente ripristinare e mantenere le caratteristiche RP successive, crediamo che utilizzando questo metodo le persone potrebbero generare rapidamente cellule RP da studi di macistate e screening di farmaci protettivi che potrebbero facilitare lo sviluppo di nuovi trattamenti per i disturbi RPE. Una dimostrazione del valore passo dopo passo renderà questo metodo molto più facile da replicare in diversi laboratori che vogliono studiare le cellule RP.Per iniziare a scongelare l'enzima di digestione tissutale malaquad e sterilizzare 1X PBS. Integrato con 2% di penicillina e 2% di streptomicina filtrando la soluzione attraverso un'unità filtrante a siringa da 0,22 micrometri. Lavare i pozzetti della piastra di coltura e gli inserti transwell con 1X PBS.Rimuovere il PBS dai pozzetti e dai transwell con una pipetta e aggiungere un millilitro di PBS 1X fresco alla camera inferiore e 600 microlitri di soluzione di Laminin da 10 microgrammi per millilitro alla camera superiore. Incubare le piastre e gli inserti transwell in questo incubatore di elicicoltura durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, rimuovere la soluzione laminata dalla camera superiore e lavare con un millilitro di PBS freddo 1X due volte prima di posizionare la cella Pulire la cappa di flusso in laminato con etanolo al 75% e luce UV.Preparare tre provette da centrifuga sterili da 50 millilitri contenenti circa 25 millilitri di etanolo al 75%, tre provette da centrifuga sterili da 50 millilitri contenenti circa 25 millilitri di 1X PBS e tre piastre di coltura cellulare sterile da 10 centimetri contenenti circa 15 millilitri di 1X PBS. Immergere quattro bulbi oculari suini in circa 15 millilitri di etanolo al 75% in una capsula di Petri di 10 centimetri e utilizzare un paio di forbici e pinze per tagliare tutti i tessuti connettivi e i muscoli residui. Per decontaminare i bulbi oculari, immergere e lavare quattro bulbi oculari in tre provette centrifughe sterili da 50 millilitri riempite con etanolo al 75% in sequenza.Quindi lavare i bulbi oculari in tre provette centrifughe sterili da 50 millilitri riempite con 1X PBS in sequenza. Capovolgere i tubi ogni minuto per lavare accuratamente i bulbi oculari. Spostare i quattro bulbi oculari in un piatto di coltura cellulare sterile di 10 centimetri contenente 1X PBS.Tagliare nuovamente la superficie esterna di ciascun bulbo oculare, per rimuovere il nervo ottico e piccoli detriti. Usa le forbici per fare un piccolo taglio all'incrocio tra limbus e sclera. E poi rimuovere la cornea, l'iride, il cristallino, il corpo vitreo e la retina neurale.Trasferire il complesso di sclera della coroide RPE in un nuovo piatto di coltura cellulare di 10 centimetri ed effettuare quattro tagli per appiattire la coppa oculare a forma di quadrifoglio. Eseguire viaggi nella digestione della soluzione EDTA posizionando i quattro complessi di sclera coroidea RPE in un nuovo piatto di 10 centimetri e versando 20 millilitri di soluzione EDTA di tripsina fresca per unire i complessi di sclera coroidea RPE. Posizionare il piatto nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per quasi 30 minuti.Dopo 30 minuti, estrarre il piatto dall'incubatore e aggiungere 20 millilitri di terreno di coltura cellulare pre-caldo con il 10% di FBS al piatto. Per neutralizzare i viaggi in soluzione EDTA utilizzare una pipetta di trasferimento da cinque millilitri per dissociare le celle RPE pipettando delicatamente più volte. Raccogliere le sospensioni cellulari in provette da centrifuga da 15 millilitri, quindi pipettare delicatamente altri 10 millilitri di terreno di coltura fresco con FBS per lavare i complessi di sclera RPE Choroids sul piatto.Raccogliere le celle RPE centrifugando i tubi a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il SuperAgent usando una pipetta e aggiungere altri cinque millilitri di terreno di coltura con FBS per risospendere le cellule. Centrifugare a 300 g per altri cinque minuti.Decantare il SuperAgent e risospendere le cellule con 12 millilitri di terreno di coltura. Successivamente seme da 100.000 a 200.000 cellule per pozzetto in 12 piastre di coltura Well o inserti transwell. Cambiare i terreni di coltura ogni due giorni e ridurre la concentrazione sierica all'1% quando le cellule coprono completamente la superficie dei pozzetti per inserto.Cambiare i terreni di coltura ogni due giorni fino a quando le cellule non vengono raccolte. Le immagini rappresentative delle cellule RPE primarie suine il giorno due, il sesto giorno e il giorno 10 sono mostrate qui. L'analisi QRTPCR dei livelli di mRNA dei geni firma nelle cellule RPE primarie suine, nelle cellule RPE umane primarie, nelle cellule ARPE 19 e nel tessuto coroideo RPE suino viene rilevata da questa immagine grafica.Qui GAP DH è stato usato come gene di pulizia per RTPCR. Quattro repliche biologiche sono state utilizzate per le cellule RPE primarie suine e una RPE 19 cellule in cui tre repliche biologiche sono state utilizzate per le cellule RPE umane primarie e il tessuto coroideo RPE suino. I livelli di espressione genica nelle cellule ARPE 19 sono stati impostati come controlli.In questa figura sono mostrate le analisi del sangue occidentale delle proteine RPE 65 nelle cellule ARPE 19 e RPE suine e nelle cellule RPE umane primarie e nei tessuti coroidei RPE suini. Vinculin è stato utilizzato qui come controllo del carico. Questa figura mostra una coltura di due settimane di cellule RPE suine in terreni DMEM Basic con 1% FBS.Le cellule coltivate con o senza Lamin sono state colorate con RPE 65, APTA di sodio e potassio, Z01 e Hex. Le misurazioni TR in fogli cellulari, coltivati con o senza laminina sono rappresentate in questa figura. L'analisi del sangue occidentale del fattore di crescita endoteliale vascolare o VEGF e del fattore derivato dall'epitelio pigmentato o PEDF nelle cellule RPE e ARPE 19 primarie suine sono mostrate in questa figura.Le funzioni settoriali delle cellule RPE e ARPE 19 primarie suine coltivate sono presentate in queste immagini. La maggior parte di questo protocollo è quello di dissolvere le cellule RP dai complessi gliali chide RPE. Si consiglia di utilizzare ogni volta viaggi e soluzioni freschi e il corretto controllo del tempo di digestione, per sciogliere otto cellule RP.

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