Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Forfatterne ønsker å vise sin takknemlighet og respekt for alle dyr som bidrar med sine celler i denne studien. Denne studien ble delvis støttet av tilskudd fra National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao og Grant nr. 2018YFA0107301, Wei Li). Forfatterne takker Jingru Huang og Xiang You fra Central Lab, School of Medicine, Xiamen University for teknisk støtte i konfokal bildebehandling.

Bruken av eksperimentelle dyr overholdt forskriftene fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) og ble godkjent av Etisk komité for eksperimentell dyreforvaltning ved Xiamen University.
1. Fremstilling av eksperimentelle kirurgiske enheter, vevsfordøyelsesenzym og cellekulturbuffer
<ol><li>Forbered de eksperimentelle kirurgiske enhetene, ved å rengjøre og autoklavere to par oftalmiske kirurgiske sakser og tang dagen før øyeeplet disseksjon, og dere...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

Her er det beskrevet en detaljert og optimalisert protokoll for isolering, kultur og karakterisering av RPE-celler fra svin øyeboller, som genererer en god modell for in vitro-karakterisering av RPE-celler og RPE-relaterte lidelsesstudier. Metoder for isolering av RPE fra menneske-, mus- og rotteøyne har tidligere blitt beskrevet23,24,25. Det er imidlertid vanskelig å få tak i menneskelige øyeepler i noen laborator...

Retinalpigmentepitelet (RPE) ligger mellom fotoreceptorer og choriocapillaris i det ytre laget av retina1 med flere funksjoner, inkludert dannelse av blod-retinalbarrieren, transport og utveksling av næringsstoffer og retinale metabolitter, resirkulering av vitamin A for å opprettholde en normal visuell syklus, og fagocytose og clearance av skurfotoreceptor ytre segmenter (POS)2,3 . Siden POS-er krever konstant selvfornyelse for å generere syn, må RPE-cellene kontinuerlig oppsluke frittliggende POS-er for å opprettholde retinal homeostase4. Derfor resulterer RPE-dysfunksjon i mange blinde øyesykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber medfødt amaurose6, diabetisk retinopati7, etc. Til nå er den eksakte patogenesen av de fleste av disse sykdommene fortsatt unnvikende. Som et resultat er RPE-cellekultur etablert for å studere RPE-cellebiologi, patologiske forandringer og underliggende mekanismer.
Som den enkleste modellen for å studere cellebiologi ble kulturen til RPE-celler startet så tidlig som på 1920-tallet8. Selv om ARPE-19 er mye brukt som RPE-celler, gir tap av pigmentering, brosteinsmorfologi, og spesielt barrierefunksjonene i denne cellelinjen mange bekymringer9. Til sammenligning tilbyr kulturen til primære humane RPE-celler et mer realistisk scenario for fysiologiske og patologiske studier9. Den relativt begrensede tilgjengeligheten begrenser imidlertid bruken av dem, og etiske problemer eksisterer alltid. I tillegg brukte flere grupper musemodeller for å dyrke RPE-celler. Imidlertid er størrelsen på museøyet liten, og en enkelt kultur krever vanligvis mange mus, noe som ikke er praktisk9. Nylig har forskere utviklet nye metoder for å bruke menneskelige embryonale stamceller eller induserte pluripotente stamceller for å utlede RPE-celler. Selv om denne teknikken har spesielt potensial for behandling av arvelige RPE-lidelser, er den tidkrevende og krever vanligvis flere måneder å generere modne RPE-celler10. For å overvinne disse problemene, introduserer vi her en lett å følge protokoll for å isolere og dyrke RPE-celler med høy renhet i laboratoriet rutinemessig. Under egnede kulturforhold kan disse cellene vise typiske RPE-funksjoner og vise typiske RPE-morfologier. Derfor kan denne kulturmetoden gi en god modell for å forstå RPE-fysiologi, studere cytotoksisitet, undersøke patologiske mekanismer for relaterte okulære sykdommer og gjennomføre narkotikaundersøkelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

Retinalpigmentepitelet (RPE) er et monolag av polariserte pigmenterte epitelceller, lokalisert mellom choroid og neuroretina i netthinnen. Flere funksjoner, inkludert fagocytose, næringsstoff / metabolitttransport, vitamin A-metabolisme, etc., utføres av RPE på daglig basis. RPE-celler er terminalt differensierte epitelceller med liten eller ingen regenerativ kapasitet. Tap av RPE-celler resulterer i flere øyesykdommer som fører til synshemming, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon. Derfor er etableringen av en in vitro-kulturmodell av primære RPE-celler, som ligner mer på RPE in vivo enn cellelinjer, kritisk for de karakteristiske og mekanistiske studiene av RPE-celler. Tatt i betraktning det faktum at kilden til menneskelige øyeboller er begrenset, lager vi en protokoll for å dyrke primære svin RPE-celler. Ved å bruke denne protokollen kan RPE-celler lett dissosieres fra voksne svin øyeboller. Deretter fester disse dissosierte cellene seg til kulturretter / innsatser, sprer seg for å danne et sammenflytende monolag, og gjenoppretter raskt viktige trekk ved epitelvev in vivo innen 2 wks. Ved qRT-PCR er det demonstrert at primære svin RPE-celler uttrykker flere signaturgener på sammenlignbare nivåer med innfødt RPE-vev, mens uttrykkene til de fleste av disse genene går tapt / sterkt redusert i humane RPE-lignende celler, ARPE-19. Videre viser immunfluorescensfargingen fordelingen av tett kryss, vevspolaritet og cytoskelettproteiner, samt tilstedeværelsen av RPE65, en isomerase som er kritisk for vitamin A-metabolisme, i dyrkede primære celler. Til sammen har vi utviklet en lett-å-følge tilnærming til kultur primære svin RPE celler med høy renhet og innfødte RPE funksjoner, som kan tjene som en god modell for å forstå RPE fysiologi, studere celletoksisitet, og lette narkotika screenings.

De primære pRPE-cellene (pRPE) hos svin ble dyrket i DMEM/basismedier med 10 % FBS, og cellemorfologi under lysmikroskop ble fotografert etter 2 dager (figur 2A), 6 dager (figur 2B) og 10 dager (figur 2C) etter såing. Etter 1 wk ble det observert et sammenflytende monolag av pigmenterte pRPE-celler med brosteinsmorfologier.
For bedre å karakterisere de primære pRPE-cellene ble primære humane RPE-cell...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Her presenteres en lett å følge metode for å dyrke primære svin retinale pigmentepitelceller in vitro .

Primær kultur av svin retinal pigment epitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

RPE-relaterte lidelser er fortsatt en stor del av blandingssykdommer, men uten effektive rester i virtuell kultur av primære RPE-celler for å tjene som en god modell for fysiologiske og patologiske studier av RPE-relaterte lidelser. I denne protokollen gir vi en enkel å følge protokoll for å dyrke primære IPC-er, som raskt kan gjenopprette og opprettholde senere RP-egenskaper, vi til Vi tror at ved å bruke denne metoden kan folk raskt generere RP-celler fra macistate-studier og beskyttende legemiddelscreeninger som kan lette utviklingen av ny behandling for RPE-lidelser. En trinnvis verdidemonstrasjon vil gjøre denne metoden mye enklere å replikere i forskjellige laboratorier som ønsker å studere RP-celler.For å begynne å tine vevsfordøyelsesenzymet malaquad og sterilisere 1X PBS. Supplert med 2% penicillin og 2% streptomycin ved å filtrere løsningen gjennom en 0,22 mikrometer sprøytefilterenhet. Vask brønnene på kulturplaten og transwell-innsatser med 1X PBS.Fjern PBS fra brønnene og transwells med en pipette og tilsett en milliliter fersk 1X PBS til underkammeret og 600 mikroliter 10 mikrogram per milliliter Laminin-løsning til det øvre kammeret. Inkuber platene og transwell innsatser i denne Heliciculture Incubator over natten ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Deretter fjerner du laminatoppløsningen fra det øvre kammeret og vasker med en milliliter kald 1X PBS to ganger før du setter inn cellen Rengjør laminatstrømningshetten med 75% etanol og UV-lys.Forbered tre 50 milliliter sterile sentrifugerør som inneholder rundt 25 milliliter 75% etanol, tre 50 milliliter sterile sentrifugerør som inneholder rundt 25 milliliter 1X PBS, og tre 10 centimeter sterile cellekulturretter som inneholder rundt 15 milliliter 1X PBS. Bløtlegg fire svin øyeepler i ca 15 milliliter 75% etanol i en 10 centimeter petriskål og bruk et par saks og tang for å kutte av alle gjenværende bindevev og muskler. For å dekontaminere øyebollene, suge og vaske fire øyeboller i tre 50 milliliter sterile sentrifugerør fylt med 75% etanol sekvensielt.Vask deretter øyebollene i tre 50 milliliter sterile sentrifugerør fylt med 1X PBS sekvensielt. Inverter rørene hvert minutt for å vaske øyebollene grundig. Flytt de fire øyeeplene til en 10 centimeter steril cellekulturskål som inneholder 1X PBS.Trim den ytre overflaten av hvert øyeboll igjen, for å fjerne optisk nerve og små rusk. Bruk saks til å lage et lite kutt i krysset mellom limbus og sclera. Og fjern deretter hornhinnen, iris, linse, glasslegemet og nevrale netthinnen.Overfør RPE choroid sclera-komplekset til en ny 10 centimeter cellekulturskål og gjør fire kutt for å flate øyekoppen i form av en firkløver. Utfør turer i EDTA-løsningsfordøyelsen ved å plassere de fire RPE choroid sclera-kompleksene i en ny 10 centimeter tallerken og helle 20 milliliter fersk trypsin EDTA-løsning for å slå sammen RPE choroid sclera-kompleksene. Plasser parabolen i cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius i nesten 30 minutter.Etter 30 minutter, ta parabolen ut av inkubatoren og tilsett 20 milliliter forvarmcellekulturmedier med 10% FBS til parabolen. For å nøytralisere turene i EDTA-løsningen, bruk en fem milliliter overføringspipette for å dissosiere RPE-cellene ved forsiktig pipettering flere ganger. Samle cellesuspensjonene i 15 milliliter sentrifugerør, og pipette deretter forsiktig ytterligere 10 milliliter ferskkulturmedier med FBS for å vaske RPE Choroids sclera-kompleksene på fatet.Samle RPE-cellene ved å sentrifugere rørene ved 300 G i fem minutter ved romtemperatur. Aspirer SuperAgent ved hjelp av en pipette og legg til ytterligere fem milliliter kulturmedier med FBS for å suspendere cellene på nytt. Sentrifuge ved 300 G i ytterligere fem minutter.Dekanter SuperAgent og suspendere cellene med 12 milliliter kulturmedier. Neste frø 100.000 til 200.000 celler per brønn inn i 12 Brønnkulturplater eller transwellinnsatser. Bytt kulturmedium annenhver dag og reduser serumkonsentrasjonen til 1% når cellene dekker overflaten av brønnene helt per innsats.Bytt kulturmedier annenhver dag til cellene høstes. De representative bildene av primære RPE-celler fra svin på dag to, dag seks og dag 10 er vist her. QRTPCR-analysen av mRNA-nivåer av signaturgener i primære svin RPE-celler, primære humane RPE-celler, ARPE 19-celler og svin RPE-choroidvev oppdages av dette grafiske bildet.Her ble GAP DH brukt som rengjøringsgen for RTPCR. Fire biologiske replikaer ble brukt til primære svin RPE-celler og en RPE 19-celler hvor tre biologiske replikasjoner ble brukt til primære humane RPE-celler og svin RPE-choroidvev. Genuttrykksnivåene i ARPE 19-celler ble satt som kontroller.Den vestlige blodanalysen av RPE 65-proteiner i ARPE 19- og svin RPE-celler og i primære humane RPE-celler og svin RPE-choroidvev er vist i denne figuren. Vinculin ble brukt her som en lastekontroll. Denne figuren viser en to ukers kultur av svin RPE-celler i DMEM Basic media med 1% FBS.Celler dyrket med eller uten Lamin ble farget med RPE 65, natriumkalium APTA, Z01 og Hex. TR-målinger i celleark, dyrket med eller uten laminin, er avbildet i denne figuren. Den vestlige blodanalysen av vaskulær endotelial vekstfaktor eller VEGF og pigmentepitelavledet faktor eller PEDF i primære svin RPE og ARPE 19 celler er vist i denne figuren.Sektorfunksjonene til dyrkede primære svin RPE og ARPE 19 celler presenteres i disse bildene. Den store delen av denne protokollen er å oppløse RP-celler fra RPE-chide glialkomplekser. Vi anbefaler å bruke nye turer og løsning hver gang og riktig kontroll av fordøyelsestiden, for å oppløse åtte RP-celler.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA uttrykk profiler av menneskelige iPS celler, retinal pigment epitelet avledet fra iPS, og Fetal Netthinne Pigment Epitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal Lentivirus Produksjon og cellekultur betingelser nødvendig for å kunne omsette Primær Menneskelig Bronkial epitelceller

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal transplantasjon av menneskelige embryonale stamcelleforskningen avledet retinal Pigment epitelceller i store øyne modell av geografiske Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primært cellekulturer fra musen netthinnens Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolasjon, kultur og genteknologi av pattedyr primærpigment epitelceller for ikke-viral genterapi

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv disseksjon og kultur av primære mus retinal pigment epitelceller

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolering av primære retinale retinale pigmenterte epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Sanntidsanalyse av bioenergetikk i primære humane retinale pigmentepitelceller ved bruk av høyoppløselig respirometri

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...