Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
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Os autores gostariam de mostrar sua gratidão e respeito a todos os animais que contribuem com suas células neste estudo. Este estudo foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de P & D da China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao e Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Os autores agradecem a Jingru Huang e Xiang You do Laboratório Central, Escola de Medicina, Universidade de Xiamen, pelo apoio técnico em imagens confocais.

O uso de animais experimentais cumpriu os regulamentos da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) e foi aprovado pelo Comitê de Ética de Manejo de Animais Experimentais da Universidade de Xiamen.
1. Preparação de dispositivos cirúrgicos experimentais, enzima de digestão tecidual e tampão de cultura celular
<ol><li>Preparar os dispositivos cirúrgicos experimentais, limpando e autoclavando dois pares de tesouras cirúrgicas oftálmicas e fórceps no di...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

Aqui, um protocolo detalhado e otimizado para o isolamento, cultura e caracterização de células RPE de globos oculares suínos, o que gera um bom modelo para caracterização in vitro de células RPE e estudos de distúrbios relacionados ao RPE foi descrito. Métodos para o isolamento do PSE de olhos humanos, camundongos e ratos foram descritos anteriormente23,24,25. No entanto, é difícil obter globos oculares huma...

O epitélio pigmentar da retina (EPR) está localizado entre fotorreceptores e coriocapilares na camada externa da retina1 com múltiplas funções, incluindo a formação da barreira sangue-retina, transporte e troca de nutrientes e metabólitos da retina, reciclagem de vitamina A para manter um ciclo visual normal e fagocitose e depuração dos segmentos externos fotorreceptores (POSs)2,3 . Como os POSs requerem auto-renovação constante para gerar visão, as células RPE precisam engolir continuamente os POSs destacados para manter a homeostase da retina4. Portanto, a disfunção do PSE resulta em muitas doenças oculares cegantes, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI)4, retinite pigmentosa (RP)5, amaurose congênita de Leber6, retinopatia diabética7, etc. Até agora, a patogênese exata da maioria dessas doenças permanece indescritível. Como resultado, a cultura de células RPE é estabelecida para estudar a biologia celular RPE, alterações patológicas e mecanismos subjacentes.
Como o modelo mais simples para estudar a biologia celular, a cultura de células RPE foi iniciada já na década de 19208. Embora o ARPE-19 seja amplamente utilizado como células RPE, a perda de pigmentação, a morfologia do paralelepípedo e, especialmente, as funções de barreira nessa linhagem celular levantam muitas preocupações9. Em comparação, a cultura de células primárias de EPR humanas oferece um cenário mais realista para estudos fisiológicos e patológicos9. No entanto, a disponibilidade relativamente limitada restringe seu uso e sempre existem questões éticas. Além disso, vários grupos usaram modelos de camundongos para cultivar células RPE. No entanto, o tamanho do olho do rato é pequeno, e uma única cultura geralmente requer muitos ratos, o que não é conveniente9. Recentemente, os cientistas desenvolveram novos métodos para usar células-tronco embrionárias humanas ou células-tronco pluripotentes induzidas para derivar células RPE. Embora essa técnica tenha um potencial particular para o tratamento de distúrbios hereditários do PSE, é demorada e geralmente requer vários meses para gerar células maduras do PSE10. Para superar esses problemas, aqui apresentamos um protocolo fácil de seguir para isolar e cultivar células RPE de alta pureza em laboratório rotineiramente. Sob condições de cultura adequadas, essas células podem exibir funções RPE típicas e exibir morfologias RPE típicas. Portanto, esse método de cultura pode fornecer um bom modelo para entender a fisiologia do EPR, estudar a citotoxicidade, investigar mecanismos patológicos de doenças oculares relacionadas e realizar exames de drogas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada de células epiteliais pigmentadas polarizadas, localizadas entre a coroide e a neurorretina na retina. Múltiplas funções, incluindo fagocitose, transporte de nutrientes / metabólitos, metabolismo da vitamina A, etc., são conduzidas pelo PSE diariamente. As células PSE são células epiteliais terminalmente diferenciadas com pouca ou nenhuma capacidade regenerativa. A perda de células PSE resulta em múltiplas doenças oculares que levam à deficiência visual, como a degeneração macular relacionada à idade. Portanto, o estabelecimento de um modelo de cultura in vitro de células primárias de EPR, que mais se assemelha ao PSE in vivo do que linhagens celulares, é fundamental para os estudos característicos e mecanicistas de células de EPR. Considerando o fato de que a fonte de globos oculares humanos é limitada, criamos um protocolo para cultivar células primárias de PSE suína. Usando este protocolo, as células RPE podem ser facilmente dissociadas dos globos oculares suínos adultos. Posteriormente, essas células dissociadas se ligam a placas / inserções de cultura, proliferam para formar uma monocamada confluente e restabelecem rapidamente as principais características do tecido epitelial in vivo dentro de 2 semanas. Por qRT-PCR, demonstra-se que as células primárias de PSE suína expressam múltiplos genes de assinatura em níveis comparáveis com o tecido RPE nativo, enquanto as expressões da maioria desses genes são perdidas/altamente reduzidas em células humanas semelhantes a RPE, ARPE-19. Além disso, a coloração por imunofluorescência mostra a distribuição de proteínas de junção apertada, polaridade tecidual e citoesqueleto, bem como a presença de RPE65, uma isomerase crítica para o metabolismo da vitamina A, em células primárias cultivadas. No total, desenvolvemos uma abordagem fácil de seguir para cultivar células primárias de PSE suíno com alta pureza e características nativas de RPE, o que poderia servir como um bom modelo para entender a fisiologia da EPR, estudar toxicidades celulares e facilitar exames de drogas.

As células primárias de PSE suíno (pRPE) foram cultivadas em meio DMEM/Basic com 10% de FBS, e a morfologia celular em microscópio de luz foi fotografada aos 2 dias (Figura 2A), 6 dias (Figura 2B) e 10 dias (Figura 2C) após a semeadura. Após 1 semana, observou-se uma monocamada confluente de células de pRPE pigmentadas com morfologias de paralelepípedos.
Para melhor caracterizar as células primá...

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Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Aqui, um método fácil de seguir para a cultura de células epiteliais primárias do pigmento da retina suína in vitro é apresentado.

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Os distúrbios relacionados ao PSE continuam sendo uma parte importante das doenças de mistura, mas sem remanescentes efetivos na cultura virtual de células primárias de EPR para servir como um bom modelo para estudos fisiológicos e patológicos de distúrbios relacionados ao PSE. Neste protocolo, fornecemos um protocolo fácil de seguir para a cultura de IPCs primárias, que poderiam restaurar e manter rapidamente as características de RP posteriores, acreditamos que, usando este método, as pessoas poderiam gerar rapidamente células RP a partir de estudos de macistate e os rastreios de drogas protetoras que poderiam facilitar o desenvolvimento de novo tratamento para distúrbios de RPE. Uma demonstração de valor passo a passo tornará este método muito mais fácil de replicar em diferentes laboratórios que desejam estudar células RP.Para começar a descongelar a enzima de digestão tecidual malaquad e esterilizar 1X PBS. Suplementado com 2% de penicilina e 2% de estreptomicina filtrando a solução através de uma unidade de filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Lave os poços da placa de cultura e as inserções transwell com PBS 1X.Retire o PBS dos poços e transwells com uma pipeta e adicione um mililitro de PBS 1X fresco à câmara inferior e 600 microlitros de 10 microgramas por mililitro de solução de laminina à câmara superior. Incubar as placas e as inserções transwell nesta Incubadora de Helicicultura durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois disso, remova a solução laminada da câmara superior e lave com um mililitro de PBS 1X frio duas vezes antes de sentar a célula Limpe o exaustor de fluxo laminado com etanol a 75% e luz UV.Prepare três tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros contendo cerca de 25 mililitros de etanol a 75%, três tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros contendo cerca de 25 mililitros de PBS 1X e três pratos de cultura de células estéreis de 10 centímetros contendo cerca de 15 mililitros de PBS 1X. Mergulhe quatro globos oculares suínos em cerca de 15 mililitros de etanol a 75% em uma placa de Petri de 10 centímetros e use uma tesoura e pinça para cortar todos os tecidos conjuntivos e músculos residuais. Para descontaminar os globos oculares, mergulhe e lave quatro globos oculares em três tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros preenchidos com etanol a 75% sequencialmente.Em seguida, lave os globos oculares em três tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros preenchidos com 1X PBS sequencialmente. Inverta os tubos a cada minuto para lavar bem os globos oculares. Mova os quatro globos oculares para um prato de cultura de células estéreis de 10 centímetros contendo 1X PBS.Apare a superfície externa de cada globo ocular novamente, para remover o nervo óptico e pequenos detritos. Use uma tesoura para fazer um pequeno corte na interseção do limbo e da esclera. E, em seguida, remova a córnea, íris, lente, corpo vítreo e retina neural.Transfira o complexo da esclera coroide RPE para um novo prato de cultura celular de 10 centímetros e faça quatro cortes para achatar o copo do olho na forma de um trevo de quatro folhas. Realize viagens na digestão de solução de EDTA colocando os quatro complexos de esclera coroide RPE em um novo prato de 10 centímetros e despejando 20 mililitros de solução EDTA de tripsina fresca para mesclar os complexos de esclera coroide de RPE. Coloque o prato na incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius por quase 30 minutos.Após 30 minutos, retire o prato da incubadora e, adicione 20 mililitros de meio de cultura celular pré-quente com 10% FBS ao prato. Para neutralizar as viagens em solução de EDTA, use uma pipeta de transferência de cinco mililitros para dissociar as células RPE pipetando suavemente várias vezes. Colete as suspensões celulares em tubos de centrífuga de 15 mililitros e, em seguida, pipete suavemente outros 10 mililitros de meios de cultura frescos com FBS para lavar os complexos de esclera de coroides RPE no prato.Recolher as células RPE centrifugando os tubos a 300 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Aspirar o SuperAgente usando uma pipeta e adicionar mais cinco mililitros de meios de cultura com FBS para suspender novamente as células. Centrífuga a 300 G por mais cinco minutos.Decantar o SuperAgente e ressuspender as células com 12 mililitros de meios de cultura. Próxima semente 100, 000 a 200, 000 células por poço em 12 placas de cultura de poço ou inserções transwell. Mudar o meio de cultura a cada dois dias e reduzir a concentração sérica para 1% quando as células cobrirem totalmente a superfície dos poços por inserção.Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células sejam colhidas. As imagens representativas das células primárias de PSE suína no segundo dia, no sexto dia e no dia 10 são mostradas aqui. A análise QRTPCR dos níveis de mRNA de genes de assinatura em células primárias de PSE suíno, células primárias de RPE humana, células ARPE 19 e tecido coroide de RPE suíno é detectada por esta imagem gráfica.Aqui, o GAP DH foi usado como o gene de limpeza para RTPCR. Quatro replicações biológicas foram usadas para células primárias de RPE suína e uma célula RPE 19, onde três replicações biológicas foram usadas para células primárias de RPE humana e tecido coroide de RPE suíno. Os níveis de expressão gênica nas células ARPE 19 foram definidos como controles.A análise sanguínea ocidental das proteínas RPE 65 em células ARPE 19 e RPE suína e em células primárias de RPE humana e tecidos coroides de RPE suíno são mostradas nesta figura. Vinculin foi usado aqui como um controle de carga. Esta figura mostra uma cultura de duas semanas de células RPE suínas em meio DMEM Basic com 1% de FBS.As células cultivadas com ou sem Lamin foram coradas com RPE 65, APTAs de sódio e potássio, Z01 e Hex. As medidas de TR em folhas celulares, cultivadas com ou sem laminina são representadas nesta figura. A análise sanguínea ocidental do fator de crescimento endotelial vascular ou VEGF e fator derivado do epitélio pigmentar ou PEDF em células primárias de PSE suíno e ARPE 19 são mostradas nesta figura.As funções setoriais das células PSE primária suína cultivada e ARPE 19 são apresentadas nestas imagens. A grande parte deste protocolo é dissolver as células RP dos complexos gliais de chide RPE. Recomendamos o uso de viagens frescas e solução a cada vez e o controle adequado do tempo de digestão, para dissolver oito células RP.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

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Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Biologia

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

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In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Análise em Tempo Real da Bioenergética em Células Epiteliais Pigmentares Pigmentares Humanas Primárias Usando Respirometria de Alta Resolução

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...