Name: primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2022-09-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Yazarlar, bu çalışmada hücrelerine katkıda bulunan tüm hayvanlara şükranlarını ve saygılarını göstermek istemektedir. Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı'ndan (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao ve Hibe no. 2018YFA0107301, Wei Li) gelen hibelerle desteklenmiştir. Yazarlar, konfokal görüntülemede teknik destek için Xiamen Üniversitesi Central Lab, Tıp Fakültesi'nden Jingru Huang ve Xiang You'ya teşekkür ediyor.

Deney hayvanlarının kullanımı, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) düzenlemelerine uygun ve Xiamen Üniversitesi Deneysel Hayvan Yönetimi Etik Kurulu tarafından onaylandı.
1. Deneysel cerrahi cihazların, doku sindirim enziminin ve hücre kültürü tamponunun hazırlanması
<ol><li>Göz küresi diseksiyonundan bir gün önce iki çift oftalmik cerrahi makas ve forseps temizleyerek ve otoklavlayarak ve daha sonra kutuyu gece boyunca 65 ° C'de ...

<ol>
	<li>Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation,+lipid+metabolism,+and+mitochondrial+injury:+Converging+pathways+in+age-related+macular+degeneration.">Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 37, 101781 (2020).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+retinitis+pigmentosa.">Gene therapy for retinitis pigmentosa.</a> Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).</li><li>den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leber+congenital+amaurosis:+genes,+proteins+and+disease+mechanisms.">Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Smith, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+pigment+in+the+pigmented+epithelium+of+the+retina+of+the+embryo+chick+eye+studied+in+vivo+and+in+vino.">Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino.</a> The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).</li><li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+in+a+dish:+Cell+cultures,+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina.">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).</li><li>D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+(iPSC-RPE).">In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE).</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>. Scientific, T Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.cn/document-connect/document">https://www.thermofisher.cn/document-connect/document</a> (2022)</li><li>. Toyota Available from: <a target="_blank" href="https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf">https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf</a> (2022)</li><li>. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol">https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol</a> (2022)</li><li>. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals</a> (2022)</li><li>. Cell Signal Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western">https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western</a> (2022)</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed+senescence+of+retinal+pigment+epithelial+cell+by+coculture+with+embryonic+stem+cell+via+the+TGFbeta+and+PI3K+pathways.">Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).</li><li>Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+function+of+the+tight+junction.">Physiology and function of the tight junction.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).</li><li>Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+changes+in+the+extracellular+matrix.">Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix.</a> Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+isolation+and+culture+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).</li><li>Sonoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li></ol>

Burada, RPE hücrelerinin domuz gözbebeklerinden izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol, RPE hücrelerinin in vitro karakterizasyonu ve RPE ile ilişkili bozukluk çalışmaları için iyi bir model oluşturmaktadır. RPE'nin insan, fare ve sıçan gözlerinden izole edilmesi için yöntemler daha önce 23,24,25 olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bazı ...

Retinal pigment epiteli (RPE), retina1'in dış tabakasındaki fotoreseptörler ve koryokapillaris arasında bulunur ve kan-retinal bariyerin oluşturulması, besin maddelerinin ve retinal metabolitlerin taşınması ve değişimi, normal bir görme döngüsünü sürdürmek için A vitamininin geri dönüşümü ve fagositoz ve dökülen fotoreseptör dış segmentlerinin (POS'lar) temizlenmesi gibi birçok fonksiyona sahiptir2,3 . POS'lar görme üretmek için sürekli kendini yenilemeyi gerektirdiğinden, RPE hücrelerinin retinal homeostazı korumak için sürekli olarak ayrılmış POS'ları yutması gerekir4. Bu nedenle, RPE disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber konjenital amaurozus6, diyabetik retinopati7 gibi birçok kör edici göz hastalığına neden olur. Şimdiye kadar, bu hastalıkların çoğunun kesin patogenezi belirsizliğini korumaktadır. Sonuç olarak, RPE hücre biyolojisini, patolojik değişiklikleri ve altta yatan mekanizmaları incelemek için RPE hücre kültürü kurulmuştur.
Hücre biyolojisini incelemek için en basit model olarak, RPE hücrelerinin kültürü 1920'lerin8'i kadar erken bir tarihte başlatıldı. ARPE-19, RPE hücreleri olarak yaygın olarak kullanılmasına rağmen, pigmentasyon kaybı, parke taşı morfolojisi ve özellikle bu hücre hattındaki bariyer fonksiyonları birçok endişeyi gündeme getirmektedir9. Buna karşılık, birincil insan RPE hücrelerinin kültürü, fizyolojik ve patolojik çalışmalar için daha gerçekçi bir senaryo sunmaktadır9. Bununla birlikte, nispeten sınırlı kullanılabilirlik kullanımlarını kısıtlar ve etik sorunlar her zaman mevcuttur. Ek olarak, birkaç grup RPE hücrelerini kültürlemek için fare modellerini kullandı. Bununla birlikte, fare gözünün boyutu küçüktür ve tek bir kültür genellikle uygun olmayan birçok fare gerektirir9. Son zamanlarda, bilim adamları insan embriyonik kök hücrelerini kullanmak için yeni yöntemler geliştirdiler veya RPE hücrelerini türetmek için pluripotent kök hücreleri indüklediler. Bu teknik kalıtsal RPE bozukluklarının tedavisi için özel bir potansiyele sahip olmasına rağmen, zaman alıcıdır ve olgun RPE hücrelerinin üretilmesi genellikle birkaç ay gerektirir10. Bu sorunların üstesinden gelmek için, burada laboratuvarda rutin olarak yüksek saflıkta RPE hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için takip edilmesi kolay bir protokol sunuyoruz. Uygun kültür koşulları altında, bu hücreler tipik RPE fonksiyonları gösterebilir ve tipik RPE morfolojileri sergileyebilir. Bu nedenle, bu kültür yöntemi RPE fizyolojisini anlamak, sitotoksisiteyi incelemek, ilgili oküler hastalıkların patolojik mekanizmalarını araştırmak ve ilaç taramaları yapmak için iyi bir model sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cells</td>
			<td>CCTCC</td>
			<td>GDC0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36101ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121621EH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>29821075P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td>For TER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>0300-0108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5196-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrocortisone</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-N0583/CS-2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liothyronine</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-A0070A/CS-4141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM(1X)+GlutaMAX Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA(100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP syringe filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCF4683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcmECL Ultra</td>
			<td>New Cell&#38;Molecular Biotech</td>
			<td>P10300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat Powdered Milk</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>SJ-MV0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+-K+ ATPase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76020</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary Human RPE cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Generous gift from Shoubi Wang lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>version 8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>K1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRE65 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>17939-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEDF antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>RARBIO</td>
			<td>RA-9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Damas-beta</td>
			<td>107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Fast qPCR Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR430A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well transwell inserts</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>19003-1-AP</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF ELISA kit</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>VAL106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A0659</td>
			<td>Recognize both human and porcine proteins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of porcine retinal pigment epithelial cells

Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki koroid ve nöroretina arasında yer alan polarize pigmentli epitel hücrelerinin tek katmanıdır. Fagositoz, besin / metabolit taşınması, A vitamini metabolizması vb. dahil olmak üzere birçok fonksiyon RPE tarafından günlük olarak gerçekleştirilir. RPE hücreleri, rejeneratif kapasitesi çok az olan veya hiç olmayan terminal olarak farklılaşmış epitel hücreleridir. RPE hücrelerinin kaybı, yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi görme bozukluğuna yol açan çoklu göz hastalıklarına neden olur. Bu nedenle, RPE'ye hücre hatlarından daha çok benzeyen primer RPE hücrelerinin in vitro kültür modelinin oluşturulması, RPE hücrelerinin karakteristik ve mekanik çalışmaları için kritik öneme sahiptir. İnsan gözbebeklerinin kaynağının sınırlı olduğu gerçeğini göz önünde bulundurarak, birincil domuz RPE hücrelerini kültürlemek için bir protokol oluşturuyoruz. Bu protokolü kullanarak, RPE hücreleri yetişkin domuz gözbebeklerinden kolayca ayrılabilir. Daha sonra, bu ayrışmış hücreler kültür tabaklarına / eklerine bağlanır, akıcı bir tek katman oluşturmak için çoğalır ve epitel dokusunun temel özelliklerini in vivo olarak 2 wks içinde hızla yeniden oluşturur. qRT-PCR ile, birincil domuz RPE hücrelerinin doğal RPE dokusu ile karşılaştırılabilir seviyelerde çoklu imza genleri eksprese ettiği, bu genlerin çoğunun ekspresyonlarının insan RPE benzeri hücrelerde, ARPE-19'da kaybolduğu / yüksek oranda azaldığı gösterilmiştir. Ayrıca, immünofloresan boyama, sıkı birleşme, doku polaritesi ve sitoiskelet proteinlerinin dağılımını ve ayrıca kültürlenmiş primer hücrelerde A vitamini metabolizması için kritik bir izomeraz olan RPE65'in varlığını gösterir. Toplamda, RPE fizyolojisini anlamak, hücre toksisitelerini incelemek ve ilaç taramalarını kolaylaştırmak için iyi bir model olarak hizmet edebilecek yüksek saflıkta ve doğal RPE özelliklerine sahip birincil domuz RPE hücrelerinin kültürüne takip edilmesi kolay bir yaklaşım geliştirdik.

Primer porsin RPE (pRPE) hücreleri DMEM/Basic ortamında %10 FBS ile kültürlendi ve ışık mikroskobu altında hücre morfolojisi tohumlamadan sonra 2 gün (Şekil 2A), 6 gün (Şekil 2B) ve 10 günde (Şekil 2C) fotoğraflandı. 1 wk'dan sonra, parke taşı morfolojileri olan pigmentli pRPE hücrelerinin birleşik bir tek katmanı gözlendi.
Primer pRPE hücrelerini daha iyi karakterize etmek için, ...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Burada, primer domuz retinal pigment epitel hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için takip edilmesi kolay bir yöntem sunulmaktadır.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

RPE ile ilişkili bozukluklar, hastalıkların harmanlanmasının önemli bir parçası olmaya devam etmektedir, ancak primer RPE hücrelerinin sanal kültüründe, RPE ile ilişkili bozuklukların fizyolojik ve patolojik çalışmaları için iyi bir model olarak hizmet edecek etkili kalıntılar yoktur. Bu protokolde, daha sonraki RP özelliklerini hızlı bir şekilde geri yükleyebilen ve koruyabilen birincil IPC'leri kültüre takip etmesi kolay bir protokol sağlıyoruz, bu yöntemi kullanarak insanların masistat çalışmalarından ve RPE bozuklukları için yeni tedavinin geliştirilmesini kolaylaştırabilecek koruyucu ilaç taramalarından hızlı bir şekilde RP hücreleri üretebileceklerine inanıyoruz. Adım adım değer gösterimi, bu yöntemin RP hücrelerini incelemek isteyen farklı laboratuvarlarda çoğaltılmasını çok daha kolay hale getirecektir.Doku sindirim enzimi malaquad'ı eritmeye başlamak ve 1X PBS'yi sterilize etmek. Çözeltiyi 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtre ünitesinden filtreleyerek% 2 penisilin ve% 2 streptomisin ile desteklenir. Kültür plakasının kuyucuklarını ve transwell eklerini 1X PBS ile yıkayın.PBS'yi kuyucuklardan ve transwelllerden bir pipetle çıkarın ve alt odaya bir mililitre taze 1X PBS ve üst odaya mililitre başına 600 mikrolitre 10 mikrogram Laminin çözeltisi ekleyin. Bu Helisykültür İnkübatöründe plakaları ve transwell eklerini gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bundan sonra, laminat çözeltisini üst odadan çıkarın ve hücreyi yerleştirmeden önce iki kez bir mililitre soğuk 1X PBS ile yıkayın Laminat akış başlığını% 75 etanol ve UV ışığı ile temizleyin.Yaklaşık 25 mililitre %75 Etanol içeren üç adet 50 mililitrelik steril santrifüj tüpü, yaklaşık 25 mililitre 1X PBS içeren üç adet 50 mililitre steril santrifüj tüpü ve yaklaşık 15 mililitre 1X PBS içeren üç adet 10 santimetre steril hücre kültürü kabı hazırlayın. Dört domuz gözbebeğini 10 santimetrelik bir Petri kabında yaklaşık 15 mililitre% 75 Etanol içine batırın ve tüm artık bağ dokularını ve kaslarını kesmek için bir çift makas ve forseps kullanın. Göz kürelerini dekontamine etmek için, sırasıyla% 75 etanol ile doldurulmuş üç adet 50 mililitre steril santrifüj tüpünde dört göz küresini ıslatın ve yıkayın.Daha sonra göz kürelerini sırayla 1X PBS ile doldurulmuş üç adet 50 mililitrelik steril santrifüj tüpünde yıkayın. Göz kürelerini iyice yıkamak için tüpleri her dakika ters çevirin. Dört göz küresini 1X PBS içeren 10 santimetrelik steril bir hücre kültürü kabına taşıyın.Optik siniri ve küçük kalıntıları çıkarmak için her göz küresinin dış yüzeyini tekrar kesin. Limbus ve skleranın kesiştiği noktada küçük bir kesim yapmak için makas kullanın. Ve sonra kornea, iris, lens, vitreus gövdesi ve nöral retinayı çıkarın.RPE koroid sklera kompleksini yeni bir 10 santimetre hücre kültürü kabına aktarın ve göz kapağını dört yapraklı yonca şeklinde düzleştirmek için dört kesim yapın. Dört RPE koroid sklera kompleksini yeni bir 10 santimetrelik kaba yerleştirerek ve RPE koroid sklera komplekslerini birleştirmek için 20 mililitre taze tripsin EDTA çözeltisi dökerek EDTA çözeltisi sindiriminde geziler gerçekleştirin. Çanağı hücre kültürü inkübatörüne yaklaşık 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yerleştirin.30 dakika sonra, çanağı inkübatörden çıkarın ve,% 10 FBS ile 20 mililitre ön sıcak hücre kültürü ortamı ekleyin. EDTA çözeltisindeki yolculukları nötralize etmek için, RPE hücrelerini birkaç kez hafifçe pipetleyerek ayırmak için beş mililitrelik bir transfer pipeti kullanın. Hücre süspansiyonlarını 15 mililitrelik santrifüj tüplerinde toplayın ve ardından RPE Choroids sklera komplekslerini çanak üzerinde yıkamak için FBS ile 10 mililitre taze kültür ortamını nazikçe pipetleyin.RPE hücrelerini, tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj ederek toplayın. SuperAgent'ı bir pipet kullanarak aspire edin ve hücreleri yeniden askıya almak için FBS ile beş mililitre kültür ortamı daha ekleyin. Beş dakika daha 300 G'de santrifüj.SuperAgent'ı boşaltın ve hücreleri 12 mililitre kültür ortamı ile yeniden askıya alın. Sonraki tohum kuyu başına 100.000 ila 200.000 hücreyi 12 Kuyu kültür plakasına veya transwell eklere yerleştirin. Kültür ortamını her iki günde bir değiştirin ve hücreler ekleme başına kuyucukların yüzeyini tamamen kapladığında serum konsantrasyonunu% 1'e düşürün.Hücreler toplanana kadar kültür ortamını her iki günde bir değiştirin. Primer domuz RPE hücrelerinin ikinci gün, altıncı gün ve 10. gündeki temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. Primer domuz RPE hücreleri, primer insan RPE hücreleri, ARPE 19 hücreleri ve domuz RPE koroid dokusundaki imza genlerinin mRNA düzeylerinin QRTPCR analizi bu grafik görüntü ile tespit edilmiştir.Burada GAP DH, RTPCR için temizlik geni olarak kullanılmıştır. Birincil domuz RPE hücreleri için dört biyolojik replikasyon ve birincil insan RPE hücreleri ve domuz RPE koroid dokusu için üç biyolojik replikasyonun kullanıldığı bir RPE 19 hücresi kullanılmıştır. ARPE 19 hücrelerindeki gen ekspresyon seviyeleri kontrol olarak belirlendi.ARPE 19 ve domuz RPE hücrelerinde ve primer insan RPE hücrelerinde ve domuz RPE koroid dokularında RPE 65 proteinlerinin Batı kan analizi bu şekilde gösterilmiştir. Vinculin burada yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Bu şekil, DMEM Basic ortamında% 1FBS ile iki haftalık bir domuz RPE hücresi kültürünü göstermektedir.Lamin ile veya Lamin olmadan kültürlenen hücreler RPE 65, sodyum potasyum APTA'lar, Z01 ve Hex ile boyandı. Lamininli veya lamininsiz kültürlenmiş hücre tabakalarındaki TR ölçümleri bu şekilde tasvir edilmiştir. Primer domuz RPE ve ARPE 19 hücrelerinde vasküler endotel büyüme faktörü veya VEGF ve pigment epitel kaynaklı faktör veya PEDF'nin batı kan analizi bu şekilde gösterilmiştir.Bu görüntülerde kültürlenmiş primer domuz RPE ve ARPE 19 hücrelerinin sektörel fonksiyonları sunulmuştur. Bu protokolün büyük kısmı, RPE chide glial komplekslerinden RP hücrelerini çözmektir. Sekiz RP hücresini çözmek için her seferinde taze geziler ve çözeltiler kullanmanızı ve sindirim süresini uygun şekilde kontrol etmenizi öneririz.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...