Name: flow cytometry analysis of murine bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells and stromal niche cells
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells at JoVE.com

LM è stato sostenuto da una sovvenzione del Lady Tata Memorial Trust. JR è stato supportato da una borsa di dottorato della Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT fellowship UI/BD/150833/2021). ML è stato supportato da una borsa di dottorato di dottorato da FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). La DD è stata sostenuta da sovvenzioni dell'American Society of Hematology, della Pablove Foundation, della FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) e della Società portoghese di ematologia. Ringraziamo il supporto della Dott.ssa Catarina Meireles ed Emilia Cardoso della struttura TRACY di i3s.

Gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati alloggiati presso la struttura per animali i3S in specifiche condizioni prive di agenti patogeni in un ciclo luce-buio di 12 ore e in un ambiente a temperatura controllata. È stato fornito l'accesso gratuito al chow e all'acqua standard dei roditori. Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane secondo i criteri delineati dalla Federazione delle associazioni europee di scienze degli animali da laboratorio per la cura e la manipolazione degli animali da laboratorio (D...

<ol>
	<li>Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niches+that+regulate+stem+cells+and+hematopoiesis+in+adult+bone+marrow.">Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow.</a> Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).</li><li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays.">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Asada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cytokine+contributions+of+perivascular+haematopoietic+stem+cell+niches.">Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).</li><li>Mosteo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+interface+between+the+bone+marrow+vascular+niche+and+hematopoietic+stem+cells+in+myeloid+malignancy.">The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).</li><li>Christodoulou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+native+haematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).</li><li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis.">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li><li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells.">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li><li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+AML.">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinct+subsets+of+lineage-biased+multipotent+progenitors+control+blood+production+in+normal+and+regenerative+conditions.">Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li><li>Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+murine+multipotent+progenitor+isolation+scheme:+Establishing+a+consensus+approach+for+multipotent+progenitor+identification.">Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification.</a> Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).</li><li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells.">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Hawkins, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li><li>Akinduro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+dynamics+of+acute+myeloid+leukaemia+and+haematopoietic+progenitors+competing+for+bone+marrow+space.">Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space.</a> Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).</li><li>Beerman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinct+hematopoietic+stem+cells+modulate+hematopoietic+lineage+potential+during+aging+by+a+mechanism+of+clonal+expansion.">Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).</li><li>Gomariz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+spatial+analysis+of+haematopoiesis-regulating+stromal+cells+in+the+bone+marrow+microenvironment+by+3D+microscopy.">Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy.</a> Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus.">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).</li><li>Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+hematopoietic+cells+develop+from+hematopoietic+stem+cells+through+Flk2/Flt3-positive+progenitor+cells.">All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).</li><li>Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hCD2-iCre+and+Vav-iCre+mediated+gene+recombination+patterns+in+murine+hematopoietic+cells.">hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).</li></ol>

Mentre il protocollo descritto è semplice e facile da eseguire, è necessario prestare particolare attenzione a passaggi specifici. Ad esempio, quando si ottiene BM lavato (fase 5.2), il volume o il numero di volte indicato per passare PBS 2% FBS attraverso l'interno della parte centrale dell'osso non deve essere superato, in quanto ciò potrebbe comportare una contaminazione significativa del campione lavato da popolazioni di cellule endosteali.
È possibile apportare modifiche al protocollo...

La citometria a flusso è un metodo inestimabile per caratterizzare e isolare prospetticamente le cellule immunitarie ed ematopoietiche. Viene anche sempre più utilizzato per analizzare popolazioni stromali ed epiteliali di diversi tessuti. La cellula staminale ematopoietica (HSC) ha proprietà uniche di auto-rinnovamento e multipotenza. Nei mammiferi adulti, le HSC risiedono principalmente nel midollo osseo (BM), dove ricevono segnali di quiescenza e sopravvivenza dal microambiente circostante o dalla nicchia1. Le HSC sono formalmente definite secondo i saggi funzionali2. Tuttavia, diversi documenti di riferimento hanno dimostrato l'utilità della citometria a flusso per identificare le HSC. Attraverso l'uso di marcatori di superficie cellulare limitati, è possibile discriminare popolazioni ematopoietiche che sono altamente arricchite in HSCs3. La citometria a flusso è, quindi, un metodo centrale nel campo delle cellule staminali. È stato ampiamente utilizzato per valutare l'impatto di tipi di cellule di nicchia putativi e fattori di nicchia sulle HSC. Combinando la citometria a flusso con l'imaging e i saggi funzionali, è stato dimostrato che le HSC sono supportate criticamente dalle cellule staminali mesenchimali perivascolari (MSC) e dalle cellule endoteliali (ECs). Le MSC BM sono un gruppo eterogeneo e hanno diversi contributi di citochine4, ma è ben noto che le MSC del recettore della leptina (LepR)+ sono cellule di nicchia chiave1. Le EC BM sono anche altamente eterogenee e possono far parte di sinusoidi, arteriole e vasi transizionali di tipo H/ 5. Diversi studi hanno dimostrato il contributo sfumato di queste diverse CE. Ad esempio, le EC sinusoidali endostre sono spazialmente più vicine alle HSC quiescenti6, mentre le HSC non migratorie con livelli più bassi di specie reattive dell'ossigeno si trovano vicino alle EC arteriolari7. Anche la posizione endostale rispetto alla posizione centrale delle nicchie è molto importante. I vasi endostali di tipo H sono associati alle cellule stromali perivascolari che vengono perse con l'invecchiamento, portando alla perdita di HSC8. Nella leucemia mieloide acuta, le EC centrali sono espanse, mentre i vasi endostali e le HSC endostali vengono persi9.
La maggior parte degli studi sul campo si sono concentrati sull'ematopoiesi stessa e sulla regolazione estrinseca delle HSC da parte della cellula. È stato, tuttavia, sempre più riconosciuto che vi è la necessità di caratterizzare meglio le nicchie che regolano altri progenitori, vale a dire i progenitori multipotenti (MPP), in particolare considerando che sono i principali driver dell'ematopoiesi allo stato stazionario10. In contrasto con una struttura gerarchica fissa, studi recenti hanno dimostrato che l'ematopoiesi è un continuum in cui le HSC si differenziano in MPP distorte in una fase iniziale11. Le MPP sono state nominate in base a diversi schemi di classificazione12, ma un recente documento di consenso della Società internazionale per l'ematologia sperimentale (ISEH) ha proposto che le MPP fossero discriminate come MPP precoci e in base alla loro distorsione linfoide (MPP-Ly), megacariocitica ed eritroide (MPP-Mk / E) e mieloide (MPP-G / M)13. L'uso della citometria a flusso sarà fondamentale per studiare ulteriormente l'importanza delle nicchie BM nella regolazione di queste popolazioni. Gli attuali metodi di citometria a flusso utilizzano strategie di gating variabili per differenziare le HSPC e identificare le cellule stromali, vale a dire le EC, utilizzando marcatori incoerenti. L'obiettivo del metodo attuale è quello di presentare un flusso di lavoro semplice e riproducibile di colorazione BM per identificare sottopopolazioni HSPC, gruppi eterogenei di EC e MSC LepR +. Riteniamo che questa tecnica, sebbene comparabile con i metodi precedentemente riportati (vedi, ad esempio, riferimento 14), fornisca un protocollo aggiornato e facile da implementare per l'analisi fenotipica delle cellule ematopoietiche nelle due aree funzionali del midollo, endostale e BM centrale 8,15, nonché delle cellule di nicchia stromale BM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD3&#949; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse/human CD11b antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrite 2 Color Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>C1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Leptin R Biotinylated Antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>BAF497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse endomucin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-5851-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Flk2 (CD135)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse CD16/32 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer 10x</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Violet Fixable Viability Dye</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423114</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of murine bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells and stromal niche cells

Il midollo osseo (BM) è il tessuto molle trovato all'interno delle ossa dove si verifica principalmente l'ematopoiesi, il processo mediante il quale vengono generate nuove cellule del sangue. Come tale, contiene cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), oltre a sostenere le cellule stromali che contribuiscono al mantenimento e alla regolazione delle HSPC. I disturbi ematologici e altri disturbi del BM interrompono l'ematopoiesi colpendo direttamente le cellule ematopoietiche e/o attraverso l'alterazione della nicchia BM. Qui, descriviamo un metodo per studiare l'ematopoiesi in salute e malignità attraverso l'analisi fenotipica di BM HSPC murini e popolazioni di nicchia stromali mediante citometria a flusso. Il nostro metodo descrive in dettaglio i passaggi necessari per arricchire le cellule BM nelle frazioni BM endostali e centrali, nonché le strategie di gating appropriate per identificare i due tipi di cellule di nicchia chiave coinvolte nella regolazione HSPC, le cellule endoteliali e le cellule staminali mesenchimali. L'analisi fenotipica qui proposta può essere combinata con mutanti murini, modelli di malattia e saggi funzionali per caratterizzare il compartimento HSPC e la sua nicchia.

I grafici rappresentativi dell'analisi citometrica a flusso di HSC e MPP in un topo C57Bl/6 adulto sano sono mostrati nella Figura 1. La strategia di gating segue l'ultima nomenclatura armonizzante proposta dall'ISEH13. Quando si analizza l'impatto di una perturbazione, come un'infezione o un cancro, è importante utilizzare un mouse di controllo come riferimento per le porte normali. I controlli a fluorescenza meno uno (FMO) possono essere particolarmente utili per d...

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Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.

Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

Il protocollo descritto consente l'analisi fenotipica delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo e delle cellule stromali del midollo osseo. Può essere usato per studiare le perturbazioni di queste popolazioni in diversi contesti. Rispetto ad altri metodi precedentemente descritti, questa tecnica consente l'analisi fenotipica delle cellule ematopoietiche, in particolare nelle due aree funzionali del midollo, endostale e midollo osseo centrale, nonché cellule stromali del midollo osseo.Per iniziare, posiziona l'animale eutanasia con la pancia in su su una capsula di Petri e spruzza con etanolo al 70%. Fai un taglio sopra l'addome usando le forbici e tira via la pelle fino alle caviglie. Afferra una delle gambe e tagliala sul fondo per separarla dall'animale usando le forbici.Quindi rimuovere il piede dalla gamba tagliando la caviglia e posizionare la gamba in PBS 2% FBS ghiacciato. Quindi, afferrare l'osso dell'anca usando una pinzetta e tagliarlo dietro di esso per separarlo dall'animale usando le forbici. Posizionare l'osso dell'anca in PBS 2% FBS ghiacciato.Dopo aver posizionato l'osso della gamba e dell'anca in una capsula di Petri, pulire le ossa usando un bisturi sterile. Quindi separare la tibia e il femore tagliando il ginocchio con il bisturi e posizionare le ossa pulite in PBS 2% FBS ghiacciato. Posizionare il femore o la tibia in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato e schiacciare l'osso premendolo delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello.Quindi, pipettare la sospensione cellulare risultante su e giù usando una pipetta da 10 millilitri per omogeneizzarla e trasferirla in un tubo da 50 millilitri attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri posto sopra il tubo. Risciacquare la malta con un altro PBS 2% FBS e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 millilitri attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 micrometri. Centrifugare il tubo da 50 millilitri a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di lisi RBC a temperatura ambiente mediante pipettaggio su e giù più volte. Dopo un'incubazione di due minuti a temperatura ambiente, aggiungere 15 millilitri di PBS 2% FBS e centrifugare il tubo da 50 millilitri. Se il pellet cellulare non appare rossastro, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra inferiore a V a 96 pozzetti per la colorazione.Dopo aver schiacciato l'osso come dimostrato in precedenza, tagliare la punta di una pipetta P1000 usando le forbici e usarla per trasferire tutto il contenuto della malta in un tubo da 50 millilitri. Quindi centrifugare il tubo da 50 millilitri a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in tre millilitri di collagenasi IV e questa soluzione di dispase-II.Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Riempire il tubo a 25 millilitri con PBS 2% FBS e vortice da miscelare. Quindi, trasferire il contenuto in un nuovo tubo da 50 millilitri attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri.Quindi aggiungere 15 millilitri di PBS 2% FBS al vecchio tubo da 50 millilitri e trasferire la soluzione nel nuovo tubo da 50 millilitri attraverso il filtro cellulare da 100 micrometri. Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone per lisi dei globuli rossi pipettando su e giù più volte con una pipetta. Dopo l'incubazione di due minuti a temperatura ambiente, aggiungere 15 millilitri di PBS 2% FBS.Ancora una volta, centrifugare il tubo e se il pellet cellulare non sembra rossastro dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra inferiore a V a 96 pozzetti per la colorazione. Quindi centrifugare la piastra a 500 G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Posizionare il femore su una piastra di Petri e tagliare le estremità dell'osso usando un bisturi sterile.Quindi lavare la parte centrale dell'osso facendo passare 100 microlitri di PBS 2% FBS attraverso l'interno dell'osso una volta da ciascun lato utilizzando una siringa da insulina da 0,5 millilitri senza volume morto e raccogliendo la soluzione in un tubo di microcentrifuga contenente un millilitro di PBS 2% FBS. Successivamente trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri etichettato come midollo osseo lavato contenente quattro millilitri di PBS 2% FBS. Schiacciare le estremità dell'osso in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato premendoli delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello.Una volta che la sospensione cellulare è omogeneizzata, trasferirla in un tubo da 50 millilitri etichettato come midollo osseo schiacciato attraverso un filtro cellulare di 40 micrometri. Infine, sciacquare la malta con un altro PBS 2% FBS e trasferire la soluzione nello stesso tubo. L'analisi citometrica a flusso delle cellule staminali ematopoietiche e dei progenitori multipotenti è stata eseguita nel midollo osseo totale in un topo C57BL6J giovane adulto sano.Nell'analisi delle cellule stromali, delle cellule endoteliali e delle cellule staminali mesenchimali nel midollo osseo totale, le cellule staminali mesenchimali possono essere facilmente identificate in base all'espressione del recettore della leptina e le cellule endoteliali possono essere identificate in base all'espressione di CD31 e SCA-1. Analisi citometrica a flusso di cellule endoteliali nel midollo osseo totale che mostra la discriminazione tra cellule endoteliali arteriolari e sinusoidali basata su ICAM1. La quantificazione delle cellule endoteliali del midollo osseo arterioso e sinusoidale nel tessuto midollare centrale ed endostale mostra che le cellule endoteliali del midollo osseo arterioso sono più abbondanti nelle regioni endosteali, mentre i sinusoidi sono più frequenti nelle aree del midollo osseo centrale.Quando si ottiene il midollo osseo arrossato, il volume o il numero di volte indicato per passare PBS 2% FBS attraverso l'interno della parte centrale dell'osso non deve essere superato. La combinazione del metodo descritto con saggi funzionali delle popolazioni cellulari fenotipicamente analizzate fornirebbe ulteriori preziose informazioni sulle potenziali perturbazioni di queste popolazioni che si verificano nelle condizioni studiate. Il protocollo descritto consente l'analisi fenotipica delle cellule ematopoietiche in modo differenziale nell'endostea e nel midollo osseo centrale, consentendo ai ricercatori di studiare le perturbazioni dell'ematopiesi che potenzialmente si verificano specificamente in queste posizioni del midollo osseo.

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

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Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

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L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

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L&#39;infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l&#39;analisi di differenziazione emopoietiche

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