Name: flow cytometry analysis of murine bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells and stromal niche cells
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells at JoVE.com

LM fue apoyado por una subvención del Lady Tata Memorial Trust. JR fue apoyado por una beca de doctorado de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Beca FCT UI/BD/150833/2021). ML fue apoyado por una beca de doctorado de FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Americana de Hematología, la Fundación Pablove, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522 / 2021) y la Sociedad Portuguesa de Hematología. Catarina Meireles y Emilia Cardoso de TRACY facility en i3s.

Los animales utilizados en este protocolo fueron alojados en la instalación de animales i3S bajo condiciones específicas libres de patógenos en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y un ambiente de temperatura controlada. Se proporcionó acceso gratuito a comida y agua estándar para roedores. Todos los animales recibieron cuidados humanitarios de acuerdo con los criterios descritos por la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencia de Animales de Laboratorio para el cuidado y manejo de animales de laboratorio (Direc...

<ol>
	<li>Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niches+that+regulate+stem+cells+and+hematopoiesis+in+adult+bone+marrow.">Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow.</a> Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).</li><li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays.">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Asada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cytokine+contributions+of+perivascular+haematopoietic+stem+cell+niches.">Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).</li><li>Mosteo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+interface+between+the+bone+marrow+vascular+niche+and+hematopoietic+stem+cells+in+myeloid+malignancy.">The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).</li><li>Christodoulou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+native+haematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).</li><li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis.">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li><li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells.">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li><li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+AML.">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinct+subsets+of+lineage-biased+multipotent+progenitors+control+blood+production+in+normal+and+regenerative+conditions.">Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li><li>Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+murine+multipotent+progenitor+isolation+scheme:+Establishing+a+consensus+approach+for+multipotent+progenitor+identification.">Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification.</a> Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).</li><li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells.">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Hawkins, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li><li>Akinduro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+dynamics+of+acute+myeloid+leukaemia+and+haematopoietic+progenitors+competing+for+bone+marrow+space.">Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space.</a> Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).</li><li>Beerman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinct+hematopoietic+stem+cells+modulate+hematopoietic+lineage+potential+during+aging+by+a+mechanism+of+clonal+expansion.">Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).</li><li>Gomariz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+spatial+analysis+of+haematopoiesis-regulating+stromal+cells+in+the+bone+marrow+microenvironment+by+3D+microscopy.">Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy.</a> Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus.">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).</li><li>Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+hematopoietic+cells+develop+from+hematopoietic+stem+cells+through+Flk2/Flt3-positive+progenitor+cells.">All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).</li><li>Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hCD2-iCre+and+Vav-iCre+mediated+gene+recombination+patterns+in+murine+hematopoietic+cells.">hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).</li></ol>

Si bien el protocolo descrito es simple y fácil de realizar, se debe prestar especial atención a los pasos específicos. Por ejemplo, al obtener BM enjuagado (paso 5.2), no se debe exceder el volumen o el número de veces indicado para pasar PBS 2% FBS a través del interior de la parte central del hueso, ya que esto podría resultar en una contaminación significativa de la muestra enjuagada por poblaciones de células endosteal.
Se pueden hacer alteraciones al protocolo para facilitar su e...

La citometría de flujo es un método invaluable para caracterizar y aislar prospectivamente células inmunes y hematopoyéticas. También se utiliza cada vez más para analizar poblaciones estromales y epiteliales de diferentes tejidos. La célula madre hematopoyética (HSC) tiene propiedades únicas de autorrenovación y multipotencia. En los mamíferos adultos, las HSC residen principalmente en la médula ósea (BM), donde reciben señales de quiescencia y supervivencia del microambiente circundante o nicho1. Las HSC se definen formalmente de acuerdo con los ensayos funcionales2. Sin embargo, varios artículos históricos han demostrado la utilidad de la citometría de flujo para identificar HSC. Mediante el uso de marcadores de superficie celular limitada, es posible discriminar poblaciones hematopoyéticas altamente enriquecidas en HSCs3. La citometría de flujo es, por lo tanto, un método central en el campo de las células madre. Se ha utilizado ampliamente para evaluar el impacto de los tipos de células de nicho putativo y los factores de nicho en las HSC. Al combinar la citometría de flujo con imágenes y ensayos funcionales, se ha demostrado que las HSC están críticamente respaldadas por células madre mesenquimales perivasculares (MSC) y células endoteliales (CE). Las MSC BM son un grupo heterogéneo y tienen diferentes contribuciones de citoquinas4, pero está bien establecido que el receptor de leptina (LepR) + MSC son células de nicho clave1. Las CE BM también son muy heterogéneas y pueden formar parte de sinusoides, arteriolas y vasos tipo H/de transición5. Diferentes estudios han demostrado la contribución matizada de estos diferentes CE. Por ejemplo, las CE sinusoidales endosteal están espacialmente más cerca de las HSC quiescentes6, mientras que las HSC no migratorias con niveles más bajos de especies reactivas de oxígeno se encuentran cerca de las CE arteriolares7. El endosteal versus la ubicación central de los nichos también es muy importante. Los vasos endosteal tipo H están asociados con células del estroma perivascular que se pierden con el envejecimiento, lo que lleva a la pérdida de HSCs8. En la leucemia mieloide aguda, las CE centrales se expanden, mientras que los vasos endosteal y las HSC endosteal se pierden9.
La mayoría de los estudios en el campo se han centrado en la hematopoyesis en sí y en la regulación extrínseca de las HSC de la célula. Sin embargo, se ha reconocido cada vez más la necesidad de caracterizar mejor los nichos que regulan otros progenitores, a saber, los progenitores multipotentes (MPP), particularmente considerando que son los principales impulsores de la hematopoyesis en estado estacionario10. En contraste con una estructura jerárquica fija, estudios recientes han demostrado que la hematopoyesis es un continuo en el que las HSC se diferencian en MPP sesgadas en una etapa temprana11. Los MPP han sido nombrados después de diferentes esquemas de clasificación12, pero un reciente documento de consenso de la Sociedad Internacional de Hematología Experimental (ISEH) propuso que los MPP sean discriminados como MPP tempranos y de acuerdo con su sesgo linfoide (MPP-Ly), megacariocítico y eritroide (MPP-Mk / E) y mieloide (MPP-G / M)13. El uso de la citometría de flujo será fundamental para estudiar más a fondo la importancia de los nichos de BM en la regulación de estas poblaciones. Los métodos actuales de citometría de flujo utilizan estrategias de activación variable para diferenciar las HSPC e identificar las células del estroma, es decir, las CE, utilizando marcadores inconsistentes. El objetivo del método actual es presentar un flujo de trabajo simple y reproducible de tinción de BM para identificar subpoblaciones de HSPC, grupos heterogéneos de CE y MSC LepR +. Creemos que esta técnica, aunque comparable con los métodos previamente reportados (ver, por ejemplo, referencia 14), proporciona un protocolo actualizado y fácil de implementar para el análisis fenotípico de células hematopoyéticas en las dos áreas funcionales de la médula, endosteal y central BM 8,15, así como células de nicho estromal BM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD3&#949; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse/human CD11b antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrite 2 Color Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>C1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Leptin R Biotinylated Antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>BAF497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse endomucin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-5851-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Flk2 (CD135)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse CD16/32 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer 10x</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Violet Fixable Viability Dye</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423114</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of murine bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells and stromal niche cells

La médula ósea (BM) es el tejido blando que se encuentra dentro de los huesos donde se produce principalmente la hematopoyesis, el proceso por el cual se generan nuevas células sanguíneas. Como tal, contiene células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), así como células estromales de soporte que contribuyen al mantenimiento y regulación de las HSPC. Los trastornos hematológicos y otros trastornos del BM interrumpen la hematopoyesis al afectar a las células hematopoyéticas directamente y/o a través de la alteración del nicho del BM. Aquí, describimos un método para estudiar la hematopoyesis en salud y malignidad a través del análisis fenotípico de HSPC de BM murino y poblaciones de nicho estromal por citometría de flujo. Nuestro método detalla los pasos necesarios para enriquecer las células BM en fracciones endosteal y central BM, así como las estrategias de compuerta apropiadas para identificar los dos tipos clave de células de nicho involucradas en la regulación de HSPC, células endoteliales y células madre mesenquimales. El análisis fenotípico propuesto aquí puede combinarse con mutantes de ratón, modelos de enfermedades y ensayos funcionales para caracterizar el compartimiento HSPC y su nicho.

En la Figura 1 se muestran gráficos representativos del análisis de citometría de flujo de HSC y MPP en un ratón C57Bl/6 adulto joven sano. La estrategia de cierre sigue la última nomenclatura armonizadora propuesta por el ISEH13. Al analizar el impacto de una perturbación, como una infección o cáncer, es importante utilizar un ratón de control como referencia para las puertas normales. Los controles de fluorescencia menos uno (FMO) pueden ser particularmente...

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Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.

Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

El protocolo descrito permite el análisis fenotípico de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea y células estromales de médula ósea. Se puede utilizar para estudiar las perturbaciones de estas poblaciones en diferentes entornos. En comparación con otros métodos descritos anteriormente, esta técnica permite el análisis fenotípico de las células hematopoyéticas, específicamente en las dos áreas funcionales de la médula ósea, endosteal y médula ósea central, así como las células del estroma de la médula ósea.Para comenzar, coloque al animal sacrificado con la barriga hacia arriba en una placa de Petri y rocíe con etanol al 70%. Haga un corte por encima del abdomen con tijeras y retire la piel hasta los tobillos. Agarra una de las patas y córtala en su parte inferior para separarla del animal usando tijeras.Luego retire el pie de la pierna cortando el tobillo y coloque la pierna en PBS 2% FBS helado. A continuación, agarre el hueso de la cadera con pinzas y córtelo detrás de él para separarlo del animal con tijeras. Coloque el hueso de la cadera en PBS 2% FBS helado.Después de colocar el hueso de la pierna y la cadera en una placa de Petri, limpie los huesos con un bisturí estéril. Luego separe la tibia y el fémur cortando la rodilla con el bisturí y coloque los huesos limpios en PBS 2% FBS helado. Coloque el fémur o la tibia en un mortero con PBS 2% FBS helado y aplaste el hueso presionándolo suavemente contra la pared del mortero con el mortero.A continuación, pipetear la suspensión celular resultante hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de 10 mililitros para homogeneizarla y transferirla a un tubo de 50 mililitros a través de un filtro celular de 40 micrómetros colocado en la parte superior del tubo. Enjuague el mortero con un poco más de PBS 2% FBS y transfiera la solución al mismo tubo de 50 mililitros a través del mismo filtro de celda de 40 micrómetros. Centrifugar el tubo de 50 mililitros a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de tampón de lisis RBC a temperatura ambiente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Después de una incubación de dos minutos a temperatura ambiente, agregue 15 mililitros de PBS 2% FBS y centrifugue el tubo de 50 mililitros. Si el pellet celular no se ve rojizo, deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet en 200 microlitros de PBS 2% FBS y transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa inferior en V de 96 pocillos para teñir.Después de aplastar el hueso como se demostró anteriormente, corte la punta de una pipeta P1000 con tijeras y úsela para transferir todo el contenido del mortero a un tubo de 50 mililitros. Luego centrifugar el tubo de 50 mililitros a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet en tres mililitros de colagenasa IV y esta solución de dispasa-II.Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Rellene el tubo a 25 mililitros con PBS 2% FBS y vórtice para mezclar. A continuación, transfiera el contenido a un nuevo tubo de 50 mililitros a través de un filtro celular de 100 micrómetros.Luego agregue 15 mililitros de PBS 2% FBS al tubo antiguo de 50 mililitros y transfiera la solución al nuevo tubo de 50 mililitros a través del filtro celular de 100 micrómetros. Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en cinco mililitros de tampón de lisis RBC pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta. Después de la incubación de dos minutos a temperatura ambiente, agregue 15 mililitros de PBS 2% FBS.Nuevamente, centrifugar el tubo y si el pellet celular no se ve rojizo después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 200 microlitros de PBS 2% FBS y transferir la suspensión celular a un pozo de una placa inferior en V de 96 pocillos para teñir. Luego centrifugar la placa a 500 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Coloque el fémur en una placa de Petri y corte los extremos del hueso con un bisturí estéril.Luego enjuague la parte central del hueso pasando 100 microlitros de PBS 2% FBS a través del interior del hueso una vez desde cada lado usando una jeringa de insulina de 0.5 mililitros sin volumen muerto y recolectando la solución en un tubo de microcentrífuga que contiene un mililitro de PBS 2% FBS. Posteriormente, transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros etiquetado como médula ósea enrojecida que contiene cuatro mililitros de PBS 2% FBS. Aplastar los extremos del hueso en un mortero con PBS 2% FBS helado presionándolos suavemente contra la pared del mortero con el mortero.Una vez que la suspensión celular esté homogeneizada, transfiérala a un tubo de 50 mililitros etiquetado como médula ósea triturada a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Por último, enjuague el mortero con un poco más de PBS 2% FBS y transfiera la solución al mismo tubo. El análisis de citometría de flujo de células madre hematopoyéticas y progenitores multipotentes se realizó en médula ósea total en un ratón C57BL6J adulto joven sano.En el análisis de células estromales, células endoteliales y células madre mesenquimales en la médula ósea total, las células madre mesenquimales se pueden identificar fácilmente en función de la expresión del receptor de leptina y las células endoteliales se pueden identificar en función de la expresión de CD31 y SCA-1. Análisis por citometría de flujo de células endoteliales en médula ósea total que muestra la discriminación entre células endoteliales arteriolares y sinusoidales basada en ICAM1. La cuantificación de las células endoteliales de la médula ósea arterial y sinusoidal en el tejido de la médula ósea central y endosteal muestra que las células endoteliales de la médula ósea arterial son más abundantes en las regiones endosteal, mientras que los sinusoides son más frecuentes en las áreas centrales de la médula ósea.Al obtener médula ósea enrojecida, no se debe exceder el volumen o número de veces indicado para pasar PBS 2% FBS a través del interior de la parte central del hueso. La combinación del método descrito con ensayos funcionales de las poblaciones celulares analizadas fenotípicamente proporcionaría información valiosa adicional sobre las posibles perturbaciones a estas poblaciones que ocurren en las condiciones estudiadas. El protocolo descrito permite el análisis fenotípico de células hematopoyéticas diferencialmente en endosteal y médula ósea central, lo que permite a los investigadores investigar las perturbaciones de la hematopía que potencialmente ocurren específicamente en estas ubicaciones de la médula ósea.

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Blood

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Investigación

Biología

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

El aislamiento de las primeras células madre hematopoyéticas murinas saco vitelino y AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Mensajeras de las células hematopoyéticas de la médula ósea

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...