Name: isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Projekte A1.1 und A1.2 des Sonderforschungsbereichs 1182 "Entstehung und Funktion von Metaorganismen"). Wir danken den Mitgliedern des Schulenburg-Labors für ihre Beratung und Unterstützung.

1. Vorbereitung von Puffern und Medien
<ol><li>Der S-Puffer wird durch Zugabe von 5,85 g NaCl, 1,123 g K2HPO4, 5,926 g KH2PO4 und 1 l deionisiertemH2Oin einen Kolben und Autoklaven für 20 min bei 121 °C hergestellt.</li>
	<li>Bereiten Sie ein viskoses Medium durch Zugabe von S-Puffer vor, der 1,2% (w/v) Hydroxymethylcellulose (die Substanz, die die Viskosität des Mediums verursacht), 5 mg/ml Cholesterin, 1 mMMgSO4, 1 mM CaCl2</su...

<ol>
	<li>Schulenburg, H., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li><li>Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Caenorhabditis+elegans+across+1.5+years+in+selected+North+German+locations:+the+importance+of+substrate+type,+abiotic+parameters,+and+Caenorhabditis+competitors.">The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors.</a> BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+at+a+slug's+pace:+possible+invertebrate+vectors+of+Caenorhabditis+nematodes.">Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+repertoire+contained+within+the+native+microbiota+of+the+model+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans.</a> The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+effects+of+C.+elegans+protective+natural+microbiota+on+host+physiology.">Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+metabolic+and+gene+regulatory+networks+modulates+the+C.+elegans+dietary+response.">Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response.</a> Cell. 153 (1), 253-266 (2013).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+systems+biology+uncovers+metabolites+affecting+C.+elegans+gene+expression+and+life+history+traits.">Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits.</a> Cell. 156 (4), 759-770 (2014).</li><li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+TOR+and+insulin+in+C.+elegans.">Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans.</a> Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li><li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour.">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li><li>Snoek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-parent+recombinant+inbred+line+population+of+C.+elegans+allows+identification+of+novel+QTLs+for+complex+life+history+traits.">A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits.</a> BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).</li><li>Avery, L., Shtonda, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+transport+in+the+C.+elegans+pharynx.">Food transport in the C. elegans pharynx.</a> Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delicate+balance+between+bacterial+iron+and+reactive+oxygen+species+supports+optimal+C.+elegans+development.">A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+life+in+compost:+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations.">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li><li>F&#233;lix, M. -. A., Duveau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+habitat+sharing+of+natural+populations+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+and+linkage+disequilibrium+in+natural+Caenorhabditis+elegans+populations.">Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations.</a> Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).</li><li>Dolgin, E. S., F&#233;lix, M. -. A., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hakuna+Nematoda:+genetic+and+phenotypic+diversity+in+African+isolates+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+animal+models+for+microbiome+research.">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+C.+elegans+and+related+nematodes.">Isolation of C. elegans and related nematodes.</a> WormBook. , 1-19 (2014).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands.">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).</li><li>Haber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites:+Evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding.">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+network+rewiring+of+propionate+flux+compensates+vitamin+B12+deficiency+in+C.+elegans.">Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans.</a> eLife. 5, 17670 (2016).</li></ol>

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist einer der am intensivsten untersuchten Modellorganismen in der biologischen Forschung. Es wurde von Sydney Brenner in den 1960er Jahren eingeführt, ursprünglich zum Verständnis der Entwicklung und der Funktion des Nervensystems29. Seitdem ist C. elegans zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung grundlegender Prozesse in allen biologischen Disziplinen geworden, einschließlich Verhaltensbiologie, Neurobiologie, Altern, Evol...

In der Natur wird C. elegans häufig in faulem Pflanzenmaterial gefunden, insbesondere in faulen Früchten wie Äpfeln oder auf Komposthaufen1. Es ist auch mit bestimmten wirbellosen Wirten wie Schnecken und Asseln assoziiert 2,3. Diese Lebensräume sind reich an Mikroben, die nicht nur als Nahrung für den Wurm dienen, sondern auch stabile Assoziationen mit ihm bilden können. Informationen zur Vielfalt natürlich assoziierter Mikroorganismen wurden erst 2016 veröffentlicht 4,5,6. Seitdem haben diese und nur wenige neuere Studien gezeigt, dass C. elegans mit einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen assoziiert ist, am häufigsten einschließlich Bakterien der Gattung Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter und einige andere 6,7,8. Mehrere assoziierte Bakterien können den Wurmdarm stabil besiedeln, wenn auch nicht alle 6,9,10,11,12. Sie sind wahrscheinlich von zentraler Bedeutung für unser Verständnis der Biologie von C. elegans, da sie Nahrung liefern, vor Krankheitserregern und möglicherweise anderen Stressoren schützen und zentrale Merkmale der Lebensgeschichte wie Fortpflanzungsrate, Entwicklung oder Verhaltensreaktionen beeinflussen können.
Zum Beispiel können natürlich assoziierte Isolate der Gattungen Pseudomonas, Ochrobactrum und auch Enterobacter oder Gluconobacter den Wurm auf unterschiedliche Weise vor Erregerinfektion und -abtötung schützen 5,6,11,13,14. Ein spezifisches Isolat der Gattung Comamonas beeinflusst die Nahrungsreaktion, Entwicklung, Lebensdauer und Fruchtbarkeit von Nematoden15,16,17. Providencia-Bakterien produzieren den Neuromodulator Tyramin und modulieren dadurch die Aktivität des Nervensystems des Wirts und die daraus resultierenden Verhaltensreaktionen18. Es wurde gezeigt, dass eine Reihe verschiedener natürlich assoziierter Bakterien die Wachstumsrate, die Fruchtbarkeit und die Verhaltensreaktionen der Bevölkerung beeinflusst 5,6,9,11,19.
Bis heute ist die genaue Vielfalt und Konsistenz der einheimischen C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg nicht vollständig verstanden, und weitere Assoziationen zwischen dem Wurm und Mikroben aus seiner Umgebung müssen noch aufgedeckt werden. Mehrere frühere Studien verwendeten Bakterienstämme, die aus einer Bodenumgebung, natürlichen C. elegans-Lebensräumen oder aus Mesokosmenexperimenten (dh Laborumgebungen, die natürliche Lebensräume nachbilden) mit C. elegans-Laborstämmen 4,5,20 isoliert wurden. Obwohl diese Studien neue Erkenntnisse über den Einfluss von Mikroben auf bestimmte Nematodenmerkmale (z.B. Nematodenstoffwechsel21) lieferten, ist die Relevanz dieser Interaktionen für die Biologie von C. elegans in der Natur unklar. Daher beschreibt dieses Manuskript die Methoden, C. elegans direkt aus der Natur zu isolieren und die natürlich assoziierten Mikroben sowohl aus einzelnen Würmern als auch aus Gruppen von Würmern zu isolieren und anschließend zu charakterisieren. Die beschriebenen Methoden sind eine aktualisierte und verbesserte Version der bisher verwendeten Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von natürlichem C. elegans und seiner nativen Mikrobiota 2,6,7. In Anbetracht der Tatsache, dass C. elegans bei der Zersetzung von Pflanzenmaterial auf der ganzen Welt weit verbreitet ist (insbesondere in verrottenden Früchten, gemäßigten Regionen und im Herbst)1,2,22,23,24,25, kann dieses Protokoll von jedem Labor angewendet werden, wann immer Interesse an einer Beziehung zu C. elegans besteht. Merkmale zu natürlich assoziierten Mikroben und damit zu einem natürlich relevanteren Kontext. Letzteres ist entscheidend für ein vollständiges Verständnis der Biologie des Fadenwurms, da aus einer Vielzahl anderer Wirtssysteme bekannt ist, dass die assoziierte Mikrobiota verschiedene Merkmale der Lebensgeschichte beeinflussen kann26, ein Aspekt, der derzeit in der Vielzahl von C. elegans-Studien in fast allen lebenswissenschaftlichen Disziplinen weitgehend vernachlässigt wird.

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		<tr>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL</td>
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			<td>multiphysics simulation software</td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans interagiert mit einer großen Vielfalt von Mikroorganismen in der Natur. Im Allgemeinen wird C. elegans häufig in faulem Pflanzenmaterial gefunden, insbesondere in faulen Früchten wie Äpfeln oder auf Komposthaufen. Es ist auch mit bestimmten wirbellosen Wirten wie Schnecken und Asseln verbunden. Diese Lebensräume sind reich an Mikroben, die als Nahrung für C. elegans dienen und auch den Nematodendarm persistent besiedeln können. Bis heute ist die genaue Vielfalt und Konsistenz der einheimischen C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg nicht vollständig verstanden. Hier beschreiben wir einen geeigneten Ansatz, um C. elegans aus der Natur zu isolieren und die Mikrobiota von Würmern zu charakterisieren. Nematoden können leicht aus Kompostmaterial, verrottenden Äpfeln, Schnecken isoliert oder durch das Platzieren von Äpfeln auf Komposthaufen angezogen werden. Die Hauptzeit für den Fund von C. elegans in der nördlichen Hemisphäre ist von September bis November. Würmer können aus gesammeltem Substratmaterial ausgewaschen werden, indem das Substrat in Pufferlösung getaucht wird, gefolgt von der Sammlung von Nematoden und deren Transfer auf Nematodenwachstumsmedium oder PCR-Puffer zur anschließenden Analyse. Wir veranschaulichen weiterhin, wie die Proben verwendet werden können, um die wurmassoziierten Mikroorganismen zu isolieren und zu reinigen und Würmer für die 16S ribosomale RNA-Analyse der Zusammensetzung der Mikrobiota-Gemeinschaft zu verarbeiten. Insgesamt können die beschriebenen Methoden neue Forschungen zur Charakterisierung der C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg anregen und so zu einem umfassenden Verständnis der Vielfalt und Stabilität der Mikrobiota des Fadenwurms als Grundlage für zukünftige funktionelle Forschung beitragen.

Der Fadenwurm C. elegans findet sich häufig in zersetzenden Früchten wie Äpfeln und auch Kompostproben. In Norddeutschland kommen C. elegans sowie kongenerische Arten (insbesondere C. remanei, aber auch C. briggsae) hauptsächlich von September bis2. November vor. Die Nematoden werden am häufigsten in zersetzendem Pflanzenmaterial gefunden, insbesondere in verrottenden Früchten wie Äpfeln oder Birnen, aber auch in Kompost, insbesondere in Material, das ein...

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Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Dieses Protokoll ermöglicht neue Einblicke in die natürliche Mikrobiota von C.elegans. Gleichzeitig können die isolierten Mikroben in kontrollierten Laborexperimenten verwendet werden, um Mikrobiota-Wirt-Interaktionen und C.elegans-Biologie zu charakterisieren. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Isolierung von Mikroben, die mit C. elegans in der Natur assoziiert sind, die daher für das Verständnis der Biologie dieses wichtigen Modellwirts in einem natürlicheren Kontext von entscheidender Bedeutung sind.Es wird hilfreich sein, mit dem Auftreten von Caenorhabditis im Vergleich zu anderen Nematoden vertraut zu sein. Das Pipettieren unter dem Sezierbereich kann anfangs eine Herausforderung sein, aber Übung wird hilfreich sein. Beginnen Sie mit dem Sammeln der Umweltproben wie Kompost oder faulen Früchten in separaten Plastiktüten, Röhrchen oder sauberen Behältern.Die Stücke der gesammelten Umweltproben gleichmäßig in einer sterilen, neun Zentimeter leeren Petrischale verteilen und etwa 20 Milliliter steriles viskoses Medium hinzufügen, um die Probe mit dem Medium zu bedecken. Suchen Sie unter dem Seziermikroskop nach Caenorhabditis-Nematoden gemäß den Richtlinien zur Isolierung von Caenorhabditis elegans und verwandten Nematoden. Mit einer 20 bis 100 Mikroliter großen Pipette die kleinstmögliche Menge Flüssigkeit mit den Caenorhabditis-Nematoden von der Platte auffangen und in die drei Zentimeter große Petrischale mit einem bis drei Milliliter sterilem M9T überführen.Um eine Wurmpopulation zu etablieren, können die einzelnen Würmer mit einem Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM auf eine Platte übertragen werden. Um die Nematoden zu waschen und die außerhalb der Nematoden vorhandenen Mikroben zu entfernen, inkubieren Sie sie in M9T für 10 bis 15 Minuten. Pipettieren Sie die kleinstmögliche Menge Flüssigkeit mit den Nematoden und geben Sie sie in eine neue sterile drei Zentimeter große Petrischale mit einem bis drei Milliliter frischem M9T.Für die unvoreingenommene Identifizierung von Nematoden-assoziierten Mikroben bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit etwa drei sterilen Perlen von einem Millimeterdurchmesser vor und fügen Sie eine Mischung aus 19,5 Mikrolitern PCR-Puffer und 0,5 Mikroliter Proteinase K pro Vertiefung hinzu. Übertragen Sie einen einzelnen gewaschenen Nematoden mit so wenig Flüssigkeit wie möglich in jedes Bohrloch. Zerlegen Sie die übertragenen Nematoden mit einem Perlenhomogenisator für drei Minuten bei 30 Hertz und zentrifugieren Sie die Platten oder Röhrchen bei 8.000 G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur, um die Flüssigkeit auf den Boden zu bekommen.Um C.elegans zu identifizieren, erhitzen Sie die Proben in einem PCR-Cycler für eine Stunde bei 50 Grad Celsius und 15 Minuten bei 95 Grad Celsius, um DNA einzelner Nematoden zu isolieren, oder verwenden Sie kommerzielle Kits, um DNA von Wurmpopulationen zu isolieren. Frieren Sie die isolierte DNA bei minus 20 Grad Celsius für die Langzeitlagerung ein. Verwenden Sie die DNA und das Primerpaar NLP 30 vorwärts und NLP 30 umgekehrt und erzeugen Sie ein 154-Basenpaar-PCR-Produkt.Um die Bakterien zu isolieren, bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit etwa drei sterilen Ein-Millimeter-Perlen, 20 Mikrolitern M9-Puffer pro Vertiefung vor und pipettieren Sie einen einzelnen gewaschenen Nematoden mit so wenig Flüssigkeit wie möglich zu jedem Brunnen. Zerlegen Sie die Nematoden wie demonstriert, bevor Sie einen Perlenhomogenisator verwenden, gefolgt von einer kurzen Zentrifugation der Platte, um die Flüssigkeit auf den Boden zu bringen. Sobald Sie fertig sind, sammeln Sie die Suspension und verdünnen Sie sie seriell in einem bis 10-Verhältnis.Platte bis zu 100 Mikroliter der verdünnten Suspension auf neun Zentimeter große Agarplatten. Dann inkubieren Sie die Platten bei 15 bis 20 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden. Um die reine Bakterienkultur zu erhalten, nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der inkubierten Platte mit einer sterilen Schlaufe oder einem Zahnstocher und streifen Sie sie auf eine neue Agarplatte, die das gleiche Agarmedium enthält, das während der Reinigung verwendet wurde.Stellen Sie sicher, dass Sie nur 1/3 der Platte verwenden. Sterilisieren Sie dann eine wiederverwendbare Schlaufe oder verwenden Sie eine neue sterile Schlaufe und ziehen Sie sie durch den ersten Streifen, um einen zweiten Streifen auf einem anderen 1/3 Teil der Probenplatte zu erzeugen. Wiederholen Sie es, indem Sie eine Schleife durch den zweiten Streifen ziehen und den dritten Streifen erstellen, um das Wachstum einer einzelnen Kolonie zu erreichen.Inkubieren Sie die Platte unter den gleichen Wachstumsbedingungen, die für die Isolierung verwendet werden, und wiederholen Sie bei Bedarf den Reinigungsschritt. Züchten Sie die reinen Kolonien in einem flüssigen Medium mit den gleichen Temperatur- und Wachstumsbedingungen. Als nächstes charakterisieren Sie die Bakterien, indem Sie die bakterielle DNA aus reinen flüssigen Kulturen extrahieren, die 16S ribosomale RNA unter Verwendung von 27 Forward- und 1495 Reverse-Primern amplifizieren und die PCR wie im Text beschrieben durchführen.Wenn die gesammelten Frucht- und Kompostproben in Petrischalen verteilt und in ein flüssiges oder viskoses Medium getaucht wurden, führte dies dazu, dass die Würmer das Substratmaterial verließen und an die Oberfläche des Mediums schwammen. Die Mikroben wurden als reine Einzelkolonien isoliert und die Reinigung spielte eine wesentliche Rolle, da einige C.elegans-assoziierte Bakterien Biofilme bilden oder leicht aggregieren können, was zu Mehrartenkulturen führt. Die PCR unter Verwendung der C.elegans-spezifischen Primer, nämlich NLP 30 vorwärts und NLP 30 reverse, führte zur Amplifikation eines 154-Basenpaar-Produkts für C.elegans.Die aus einzelnen Würmern isolierte DNA führte zu schwachen PCR-Banden, während die DNA-Extraktion aus den Wurmpopulationen, die aus mindestens 50 Würmern bestanden, eine größere Menge und klarere Banden ergab. Der Erfolg der C.elegans-spezifischen PCR wurde bestätigt, indem die DNA eines Laborstamms namens N2 als Positivkontrolle gleichzeitig mit der DNA der isolierten Nematoden durchgeführt wurde. Mikroben sind überall. Daher ist es wichtig, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, um sicherzustellen, dass die isolierten Mikroben wirklich mit dem Wurm in der Natur verbunden sind.Die isolierten Mikroben können verwendet werden, um Wirt-Mikrobiota-Interaktionen oder die Rolle von Mikroben auf die Wirtsbiologie, zum Beispiel Alterung, Entwicklung oder Immunität in kontrollierten Laborexperimenten zu untersuchen. Mikroben, die mit dieser Technik isoliert wurden, werden derzeit von der C.elegans-Gemeinschaft verwendet, um das Verständnis der Mikrobiota-Vielfalt auf die Wirtsfitness oder die Rolle von Mikroben auf die Immunität zu verbessern.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Forschung

Biologie

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Collection, Isolierung und Anreicherung von natürlich vorkommenden Magnetotaktische Bakterien aus der Umwelt

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...