Name: high spatial resolution chemical imaging of implant-associated infections with x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue
Uploaded: 2022-09-30T15:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare la Clemson University, COMSET e Clemson SC BioCRAFT. La configurazione XELCI è stata inizialmente sviluppata con fondi di NSF CAREER CHE 12255535 e successivamente da NIH NIAMS R01 AR070305-01.

Questa procedura segue i protocolli di utilizzo degli animali approvati dal Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Gli esperimenti sono condotti secondo il Comitato per la biosicurezza della Clemson University (IBC) e il comitato per la sicurezza delle radiazioni (RSC), nonché seguendo le linee guida e i regolamenti pertinenti.
NOTA: Un diagramma di flusso del completamento di una scansione XELCI è mostrato di seguito nella Figura 5</stro...

<ol>
	<li>Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implant+infection+and+infection+resistant+materials:+A+mini+review.">Implant infection and infection resistant materials: A mini review.</a> International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).</li><li>Renick, P., Tang, L., Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Device-related+infections.">Device-related infections.</a> Racing for the Surface. , 171-188 (2020).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Metsemakers, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture-related+infection:+A+consensus+on+definition+from+an+international+expert+group.">Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group.</a> Injury. 49 (3), 505-510 (2018).</li><li>Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implant+infections:+Adhesion,+biofilm+formation+and+immune+evasion.">Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).</li><li>Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Imaging+of+Bacterial+Infection:+The+State+of+the+Art+and+Future+Directions.">Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).</li><li>vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+in+Osteomyelitis+and+Prosthetic+Bone+and+Joint+Infections:+A+Systematic+Review.">PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review.</a> Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).</li><li>Trampuz, A., Zimmerli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+Treatment+of+infections+associated+with+fracture-fixation+devices.">Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices.</a> Injury. 37 (2), 59-66 (2006).</li><li>Ady, J., Fong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+for+infection:+From+visualization+of+inflammation+to+visualization+of+microbes.">Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes.</a> Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).</li><li>Truong-Bolduc, Q. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+NorB+Efflux+pump+in+the+adaptation+of+Staphylococcus+Aureus+to+growth+at+acid+pH+and+in+resistance+to+Moxifloxacin.">Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).</li><li>Hengge-Aronis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+regulatory+mechanisms+involved+in+control+of+the+&#963;S+(RpoS)+subunit+of+RNA+polymerase.">Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the &#963;S (RpoS) subunit of RNA polymerase.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).</li><li>Gao, R., Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phosphors+for+x-ray+detection.">Molecular phosphors for x-ray detection.</a> Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).</li><li>Gao, R., Fang, X., Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+stimuli-responsive+luminescent+films.">Recent developments in stimuli-responsive luminescent films.</a> Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).</li><li>Uzair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformal+coating+of+orthopedic+plates+with+x-ray+scintillators+and+ph+indicators+for+x-ray+excited+luminescence+chemical+imaging+through+tissue.">Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).</li><li>Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasively+imaging+pH+at+the+surface+of+implanted+orthopedic+devices+with+x-ray+excited+luminescence+chemical+imaging.">Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging.</a> ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).</li><li>Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+calculating+growth+parameters+by+optical+density+measurements.">Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).</li><li>Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., M&#252;ller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+thermal+properties+of+biological+tissues.">Review of thermal properties of biological tissues.</a> Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).</li><li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiologic+and+Near-Infrared/Optical+Spectroscopic+Imaging:+Where+Is+the+Synergy.">Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy.</a> American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).</li><li>Ryan, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+X-ray-excited+emissions+from+quantum+dots+and+biological+tissue+in+whole+mouse.">Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19223 (2019).</li><li>Yang, Y., Wang, K. -. Z., Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralong+persistent+room+temperature+phosphorescence+of+metal+coordination+polymers+exhibiting+reversible+pH-responsive+emission.">Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).</li><li>Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+functional+X-ray+imaging+techniques+and+contrast+agents.">Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469 (2012).</li><li>Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pH+gradient+within+a+biofilm+is+dependent+upon+the+limiting+nutrient.">Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient.</a> Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).</li><li>Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+measurements+of+dissolved+oxygen,+pH+and+redox+potential+of+biocathode+microenvironments+using+microelectrodes.">In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes.</a> Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).</li><li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+probing+the+effect+of+potentials+on+the+microenvironment+of+heterotrophic+denitrification+biofilm+with+microelectrodes.">In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes.</a> Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).</li><li>Nakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+design+latent+ratiometric+fluorescent+pH+probes+Based+on+self-assembled+SNARF+derivatives.">A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives.</a> RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).</li><li>Villano, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+multislice+sequence+for+3D+MRI-CEST+pH.">A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).</li></ol>

Per essere in grado di rilevare e studiare precocemente le infezioni ortopediche associate agli impianti per evitare complicazioni da osteomielite e procedure chirurgiche secondarie, abbiamo introdotto XELCI come una nuova tecnica di imaging funzionale. È paragonabile alle tecniche attualmente disponibili per il monitoraggio del pH attraverso i tessuti.
Durante il posizionamento del campione per l'imaging, utilizziamo una testa a croce laser collegata a ottiche di messa a fuoco policapillare ...

Negli Stati Uniti, circa 2 milioni di dispositivi di fissazione delle fratture vengono inseriti ogni anno e il 5% -10% di essi porta a infezioni associate all'impianto1. Queste infezioni sono più difficili da trattare con antibiotici nelle fasi successive a causa dell'eterogeneità e della natura resistente agli antibiotici dei biofilm 2,3. Se vengono diagnosticate precocemente, le infezioni possono essere trattate con antibiotici e sbrigliamento chirurgico per evitare costi medici aggiuntivi per un secondo intervento chirurgico per sostituire l'hardware nel sito di frattura trattato. La radiografia semplice e altre tecniche radiografiche avanzate sono applicate nella diagnosi di infezioni ortopediche associate a impianti, non unioni e complicanze correlate. Sebbene queste tecniche siano utilizzate frequentemente per acquisire informazioni strutturali dell'osso e del tessuto circostante presso l'impianto ortopedico, non sono in grado di fornire informazioni biochimiche nell'ambiente specifico. Pertanto, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di imaging chimico a luminescenza eccitata a raggi X (XELCI) per l'imaging ad alta risoluzione di informazioni biochimiche in modo non invasivo nel sito dell'impianto. La diagnosi di infezioni ortopediche associate agli impianti viene comunemente effettuata con uno o una combinazione di mezzi diversi. Le osservazioni cliniche (dolore, gonfiore, arrossamento, secrezione della ferita, ecc.) suggeriscono i primi segni di infezione. Successivamente, vengono effettuati esperimenti radiologici e di laboratorio per confermare il fallimento della progressione della guarigione ossea e identificare l'organismo patogeno 4,5. Tecniche di medicina nucleare come la tomografia computerizzata (TC), la risonanza magnetica (MRI) e metodi radionucleotidici come la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) e la tomografia ad emissione di positroni (PET) sono in uso per una migliore visualizzazione dell'impianto infetto e dell'infezione associata 6,7. La TC e la risonanza magnetica sono vantaggiose nel determinare rispettivamente la necrosi ossea e le anomalie dei tessuti molli, ma causano interferenze a distanza ravvicinata dagli impianti metallici8. Diverse metodologie a raggi X come SPECT e PET in combinazione con analiti marcati con radioisotopi come agenti di contrasto di imaging in vivo sono ampiamente utilizzate per diagnosticare l'osteomielite 2 associata all'impianto. Le applicazioni attuali combinano sia i dati della scansione TC che i dati di etichettatura della SPECT o della PET per generare informazioni anatomiche9. Sebbene una o più di queste modalità di imaging siano utilizzate per aiutare la diagnosi dell'infezione, non possono rilevare precocemente le variazioni di pH associate all'infezione per iniziare i trattamenti con antibiotici per evitare spese mediche e chirurgiche extra.
Il vantaggio principale dell'utilizzo del sistema di imaging utilizzato in questo studio per il monitoraggio delle infezioni associate all'impianto è la sua capacità di rivelare informazioni biochimiche sul microambiente del biofilm con un riferimento spettrale. Sebbene l'obiettivo principale sia l'imaging e la mappatura del pH nel sito infetto, questo metodo può essere modificato per monitorare altri biomarcatori specifici per le infezioni associate all'impianto. Pertanto, XELCI consente di comprendere la fisiopatologia dell'infezione. L'imaging ad alta risoluzione spaziale consente di mappare l'eterogeneità man mano che l'infezione cresce. Il pH sulla superficie in cui si verifica la formazione del biofilm è molto importante per comprendere i cambiamenti biochimici. Inoltre, altri cambiamenti del microambiente possono verificarsi a causa di risposte allo stress correlate agli antibiotici da parte dei batteri10,11. Grazie all'imaging specifico della superficie e ad alta risoluzione spaziale, è possibile monitorare l'effetto antibiotico sul microambiente del biofilm. La tecnica può anche essere utilizzata per studiare l'ambiente del biofilm per esperimenti mirati di somministrazione di farmaci. Possiamo studiare il rilascio mirato di farmaci a basso pH o l'aumento del pH per renderli più suscettibili a lavorare a pH più alti.
Tre caratteristiche specifiche di questa tecnica di imaging sono la risoluzione dei raggi X, la specificità della superficie dell'impianto e la sensibilità chimica (Figura 1A). Queste caratteristiche possono essere confrontate con le tecniche di imaging attualmente disponibili per l'imaging delle infezioni correlate agli impianti ortopedici (Figura 1B). Una volta irradiate con i raggi X, le particelle di fosforo rivestite sulla superficie dell'impianto generano luce rossa e vicina all'IR (NIR) che può penetrare attraverso alcuni centimetri di tessuto (anche se con una certa attenuazione)12,13. La Tabella 1 mostra alcune delle caratteristiche del sistema di imaging sviluppato rispetto ad altri modi che sono stati utilizzati per misurare il pH nei biofilm o attraverso i tessuti.
XELCI è una nuova tecnica di imaging per acquisire informazioni chimiche ad alta risoluzione spaziale otticamente vicino a dispositivi medici impiantati in combinazione con l'eccitazione a raggi X, come mostrato nella Figura 2. Qui viene utilizzata l'eccitazione selettiva e la rilevazione ottica di particelle di fosforo eccitabili a raggi X. L'impianto è rivestito con due strati, uno strato polimerico incorporato in colorante sensibile al pH su uno strato di particelle scintillatrici. Una volta che una sequenza di fasci di raggi X focalizzati irradia l'impianto, lo strato scintillatore genera luce visibile (620 nm e 700 nm). Questa luce prodotta passa attraverso lo strato sensibile al pH modulando lo spettro di luminescenza a seconda del pH dell'ambiente circostante. Il basso pH è generalmente associato all'infezione e alla formazione di biofilm; man mano che l'infezione progredisce, il pH cambia da pH fisiologico (pH 7,2) ad acido (inferiore a pH 7) e il colorante pH nel sensore cambia colore e quindi assorbanza. La variazione dello spettro di luminescenza è mostrata nella Figura 2E per il colorante a pH verde Bromocresolo a pH 7 e pH 4. La luce trasmessa attraverso il tessuto e l'osso viene raccolta e il rapporto spettrale determina il pH. Per generare un'immagine del pH, il fascio di raggi X focalizzato irradia un punto alla volta nel film scintillatore e scansiona il fascio punto per punto attraverso il campione. In precedenza, questa tecnica è stata applicata per visualizzare la variazione del pH sulla superficie degli impianti ortopedici14,15 e l'ho testata per monitorare le variazioni di pH nel canale intramidollare attraverso ossa e tessuti.
La figura 3 seguente mostra uno schema del sistema di imaging. I componenti di base del sistema di imaging sono la sorgente di eccitazione a raggi X con ottica poli capillare, una guida di luce acrilica monopezzo che si collega a due tubi fotomoltiplicatori, lo stadio motorizzato x, y e z (corsa 30 cm x 15 cm x 6 cm) e il computer collegato per l'acquisizione dei dati. La sorgente di raggi X, lo stadio x, y, z e le ottiche di raccolta (gomito, guida luminosa, tubi fotomoltiplicatori (PMT)) sono nell'involucro a prova di raggi X, mentre il controller a raggi X, la fonte di alimentazione per PMT, il generatore di funzioni collegato alla scheda di acquisizione dati (DAQ) e il computer sono tenuti all'esterno. Un pulsante, normalmente aperto, posto tra l'involucro e la parte anteriore della porta funge da interblocco. Se la porta non è completamente chiusa (l'interruttore di interblocco è aperto), la sorgente di raggi X non si accende e spegne automaticamente la sorgente di raggi X se viene aperta durante il funzionamento. I motori possono eseguire una scansione continua e possono essere spostati in qualsiasi posizione discreta. La velocità di scansione per l'asse y è solitamente 1-5 mm/s, mentre la dimensione del passo sull'asse x può essere scelta tipicamente tra 150-2000 μm. I parametri possono essere scelti in base alla risoluzione spaziale richiesta. Anche i tempi di esposizione sono confermati da una velocità costante durante una scansione continua.
Una volta che il fascio di raggi X focalizzato viene irradiato sulle particelle di luminescenza dei raggi X, la luce generata passerà attraverso la pellicola sensibile al pH modulando la luce a seconda del pH circostante. La luce trasmessa interagirà (si diffonderà e assorbirà parzialmente) con un tessuto, mentre l'attenuazione della luce per diffusione e assorbimento aumenterà all'aumentare dello spessore del tessuto. L'ottica della collezione include una guida luminosa in acrilico biforcato monopezzo dotata di un gomito in alluminio riflettente (con curvatura a 90° e superficie interna riflettente lucida) all'inizio. Questo per garantire che la luce venga collimata non appena la luce raggiunge la guida luminosa. Queste aggiunte hanno migliorato significativamente l'efficienza di raccolta della luce. Per ulteriori dettagli, la Figura 4 mostra i disegni della macchina del gomito e della guida luminosa. Il gomito a 90° è stato lavorato in alluminio con la superficie interna lucidata a specchio e la guida luminosa è stata lavorata con acrilico. Abbiamo anche collegato un filtro luce blu passa-lungo ad ampio raggio (che blocca la luce a 350-450 nm) all'inizio del gomito per garantire che solo la luce rossa passi attraverso. L'estremità della guida di luce acrilica monopezzo si biforca in due flussi che portano a due diversi PMT. I PMT sono racchiusi in una piccola scatola metallica a tenuta di luce che è in contatto con un dispositivo di raffreddamento termoelettrico per raffreddare i PMT a ~ 5 ° C. All'inizio di uno dei PMT, un filtro passa-lungo a raggio stretto (bloccando la luce a 570-640 nm e passando la luce a 640-740 nm) è collegato per misurare solo la luce a 700 nm. Pertanto, la luce da 620 nm e 700 nm può essere calcolata separatamente. I PMT sono impostati in modalità di conteggio dei fotoni e generano impulsi logici transistor-transistor (TTL) per ogni fotone rilevato. Un sistema DAQ conta gli impulsi (punto di saturazione 20 milioni di impulsi al secondo) utilizzando la comunicazione USB. Dopo l'elaborazione dei dati vengono generate due mappe di intensità separate e viene creata un'immagine finale considerando il rapporto tra l'intensità della lunghezza d'onda del segnale (620 nm) e l'intensità della lunghezza d'onda di riferimento (700 nm). Questo rapporto tiene conto delle differenze nell'efficienza totale di raccolta della luce, che dipendono fortemente dalla posizione dell'ottica di raccolta, dall'intensità dell'irradiazione a raggi X e dallo spessore del tessuto. Inoltre, una regione di riferimento spazialmente separata senza alcun colorante indicatore di pH tiene conto della distorsione spettrale dovuta alla penetrazione tissutale dipendente dalla lunghezza d'onda. Per il controllo del sistema di imaging viene utilizzato un linguaggio di programmazione basato su grafica e di seguito viene illustrato un diagramma di flusso di base dell'operazione. La configurazione delle immagini, ad eccezione del computer, del controller a raggi X e dell'unità DAQ, è racchiusa in un involucro a raggi X sicuro per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 degree elbow</td>
			<td>Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo Cresol Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45ZW10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo Thymol Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-59-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate</td>
			<td>Pollock industries, White River, VT, USA</td>
			<td>TCP 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road 
			Hudson, NH 03051</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 &#181;m</td>
			<td>Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England</td>
			<td>UKL63/N-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)</td>
			<td>Motion Control, Smithtown, NY, USA</td>
			<td>AT10-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>National instruments c-DAQ 9171</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX</td>
			<td>NI cDAQ&#8482;-9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One piece acrylic light guide</td>
			<td>Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 4 buffer</td>
			<td>VWR BDH Chemicals</td>
			<td>BDH5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 8 buffer</td>
			<td>VWR BDH Chemicals</td>
			<td>BDH5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA. USA</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo multiplier tubes Model P25PC-16</td>
			<td>SensTech, Surrey, UK</td>
			<td>Model P25PC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>&#160;T0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>EMD Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>1005255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray source-iMOXS</td>
			<td>Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel</td>
			<td>Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA</td>
			<td>LTS300 and LTS150</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high spatial resolution chemical imaging of implant-associated infections with x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue

Le infezioni microbiche associate ai dispositivi medici impiantabili sono una delle principali preoccupazioni nel fallimento della fissazione delle fratture. La diagnosi precoce di tale infezione consentirà di eradicare con successo con antibiotici senza costi aggiuntivi per un secondo intervento chirurgico. Qui, descriviamo XELCI come una tecnica con elevata risoluzione dei raggi X, specificità dell'impianto e sensibilità chimica alle concentrazioni chimiche di immagini non invasive vicino alla superficie dei dispositivi medici impiantati. I dispositivi sono rivestiti con superfici di segnalazione chimica. Questa superficie chimicamente sensibile è costituita da due strati rivestiti su un dispositivo medico impiantabile; uno strato sensibile al pH (idrogel incorporato blu di bromotimolo o verde bromocresolo) che viene rivestito su uno scintillatore che emette luce rossa (Gd 2 O2S: Eu) per il monitoraggio. Un fascio di raggi X focalizzato irradia un punto sull'impianto e la luce rossa generata dallo scintillatore (con picchi di 620 nm e 700 nm) viene trasmessa attraverso lo strato di rilevamento che altera il rapporto spettrale a seconda del pH. Un'immagine viene generata scansionando il fascio di raggi X attraverso l'impianto e misurando il rapporto spettrale della luce che passa attraverso il tessuto punto per punto. Abbiamo utilizzato questa tecnica di imaging per monitorare le infezioni associate all'impianto precedentemente sulla superficie ossea del femore con un sensore a piastra impiantabile modificato. Ora stiamo studiando i cambiamenti di pH che si verificano dalle infezioni midollari tibiali dei bastoncelli intramidollari. Due diversi tipi di disegni di bastoncelli intramidollari sono utilizzati negli studi pre-pilota sui conigli e abbiamo appreso che la tecnica XELCI potrebbe essere utilizzata per monitorare eventuali cambiamenti chimici che si verificano non solo sulla superficie ossea ma anche all'interno dell'osso. Pertanto, ciò consente l'imaging locale non invasivo, ad alta risoluzione spaziale e a basso pH di fondo per studiare la biochimica delle infezioni associate all'impianto.

Come studio preliminare, abbiamo ripreso il sensore dell'asta intramidollare in una tibia alesata di un cadavere di coniglio14. Il sensore ha tre regioni distinte: la regione di riferimento, la regione pH 8 (pH basico) e la regione pH 4 (pH acido). La regione di riferimento è la particella scintillatrice (Gd 2O2S:Eu) incorporata in film epossidico irruvidito. Le regioni distintive del pH acido e basico rappresentano situazioni infette e non infette all'interno del canale int...

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High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento ottico ad alta risoluzione di informazioni chimiche intorno a dispositivi medici impiantati con imaging chimico a luminescenza eccitata a raggi X (XELCI). Questa nuova tecnica di imaging è stata sviluppata nel nostro laboratorio che consente di studiare la biochimica delle infezioni associate agli impianti.

Imaging chimico ad alta risoluzione spaziale delle infezioni associate all'impianto con luminescenza eccitata a raggi X Imaging chimico attraverso il tessuto

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will ...

Questa tecnica ci permetterà di visualizzare e mappare i cambiamenti biochimici delle infezioni associate all'impianto attraverso ossa e tessuti. Possiamo ottenere immagini ad alta risoluzione delle variazioni delle concentrazioni chimiche vicino alle superfici dell'impianto. Questo ci permetterà di monitorare l'ambiente chimico locale vicino alle infezioni associate all'impianto.A dimostrare la procedura di coltura batterica sarà Erin Levon, una studentessa laureata presso il Dipartimento di Scienze Biologiche. Per iniziare, attivare il dispositivo di raffreddamento PMT ed eseguire il resto dei passaggi di inizializzazione prima di attivare i PMT. Quindi aprire il software di controllo del sistema di imaging e spostare l'asse x e l'asse y dello stadio nella posizione iniziale desiderata.Posizionare il campione sul palco xyz mobile e posizionare l'altezza del campione in modo che il dispositivo luminescente radio sia da 5 a 5,5 centimetri al di sotto dell'ottica di messa a fuoco del policapillare sollevando o abbassando la sorgente di raggi X e / o lo stadio. Inoltre, posizionare il campione nel piano x-y con l'aiuto della traversa laser e rimuovere l'ottica di messa a fuoco per ottenere la radiografia semplice del campione. Fissare l'interblocco a pulsante sulla porta anteriore dell'alloggiamento di imaging.Quindi accendere l'alimentazione per la sorgente di raggi X. Quindi, aprire il software di controllo a raggi X. Impostare l'alimentazione dei raggi X e aprire l'otturatore a raggi X con il software di controllo a raggi X.Quindi aprire il software per la fotocamera a raggi X e premere il pulsante Esposizione per eseguire la radiografia normale. Spegnere l'esposizione e la radiografia, quindi aprire la porta del recinto. Collegare nuovamente l'ottica poli capillare alla sorgente di raggi X.Quindi chiudere l'enclosure, fissare l'interblocco e accendere l'alimentatore PMT. Quindi, aprire il software di controllo del sistema di imaging e specificare la dimensione del passo, la velocità di scansione e l'area di scansione. Una volta impostati tutti i parametri, avviare la scansione premendo il pulsante Esegui.Eseguire una scansione in background con la radiografia spenta per determinare i conteggi scuri da qualsiasi luce presente nell'involucro diversa dal campione. Dopo essersi assicurati che il campione sia nella posizione corretta con la traversa laser, chiudere l'involucro e fissare l'interblocco. Quindi aprire il software di controllo del sistema di imaging e immettere i valori per le dimensioni del passo, la velocità di scansione e l'area di scansione.Una volta impostati tutti i parametri, premere il pulsante Esegui per avviare la scansione e ottenere la scansione del campione con la radiografia accesa. Innanzitutto, eseguire la scansione a bassa risoluzione con dimensioni di passo maggiori e velocità di scansione più elevate per ottenere un'immagine preliminare della destinazione. Dopo aver ottenuto una scansione a bassa risoluzione dell'area desiderata del campione, ottenere la scansione a risoluzione più elevata con una dimensione del passo inferiore e una velocità di scansione inferiore.Per preparare una nuova coltura di stafilococco aureo 1945, utilizzare una colonia da una piastra di agar di soia triptica, striata entro una settimana per inoculare tre millilitri di brodo di soia triptico sterile. Quindi agitare delicatamente la coltura batterica a 37 gradi Celsius per 16-18 ore fino alla fase stazionaria. Quindi, pellettare la coltura dal brodo di soia triptico tramite centrifugazione a 4.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare il pellet due volte con PBS.Quantificare la concentrazione batterica utilizzando la densità ottica a 600 nanometri utilizzando l'intervallo lineare, che è l'intervallo di densità ottica in cui viene verificata la legge di Beer-Lambert. Quindi diluire il campione 200.000 cellule per millilitro usando PBS sterile. Sterilizzare l'agar di soia triptico in autoclave e quindi raffreddare mescolando fino a quando la temperatura raggiunge i 45 gradi Celsius.Quindi, inoculare i batteri nell'agar di soia triptico. Quindi, pipetare la coltura batterica diluita sulla superficie del sensore impiantabile e 100 microlitri di agar di soia triptica non inoculata su un altro impianto sterile come controllo. Aggiungere altri 100 microlitri di agar di soia triptica non inoculata sul sensore impiantabile prima che venga incubato a 37 gradi Celsius per 48 ore prima dell'impianto.Dopo aver completato la scansione, le immagini rispettivamente a 620 nanometri, 700 nanometri e rapporto sono state generate in MatLab e il cambiamento di colore era indicativo dei cambiamenti nel pH. Poiché la regione del pH di base assorbe significativamente la luce emessa rispetto alla regione del pH acido, la regione del pH più basso appare come un segnale più luminoso a 620 nanometri. L'emissione dello scintillatore a 700 nanometri funge da riferimento spettrale per le incongruenze nel film scintillatore, i cambiamenti nella composizione del tessuto e qualsiasi cambiamento che si verifica nella posizione dell'ottica di rilevamento dalla scansione alla scansione.Il campione deve essere posizionato correttamente sul palco. L'alimentazione PMT deve essere spenta prima di accendere la luce della stanza o aprire l'involucro e deve essere eseguita una scansione a bassa risoluzione prima dell'imaging ad alta risoluzione. Invece della sorgente di raggi X, possiamo utilizzare una sorgente di ultrasuoni per eseguire l'imaging chimico a luminescenza ad ultrasuoni per monitorare i cambiamenti di pH associati ai dispositivi medici impiantati.Sì, dopo l'ottimizzazione del sistema, siamo stati in grado di rilevare variazioni di pH nella cavità intramidollare dell'osso rispetto alla superficie ossea che potrebbe essere utilizzata per studiare l'osteomielite.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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