Name: visualizing the conformational dynamics of membrane receptors using single-molecule fret
Uploaded: 2022-08-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire Reza Vafabakhsh pour leurs discussions. Ce travail a été soutenu par la subvention R01GM140272 des National Institutes of Health (à R.V.), par le Searle Leadership Fund for the Life Sciences de la Northwestern University et par le Chicago Biomedical Consortium avec le soutien des Searle Funds du Chicago Community Trust (à R.V.). B.W.L. a été soutenu par la subvention de formation T32GM-008061 du National Institute of General Medical Sciences (NIGMS).

Le flux de travail global du protocole est décrit à la figure 1.
1. Préparation de la chambre d’échantillonnage
<ol><li>Nettoyage des glissières et des lamelles de couverture NOTE: Ces étapes visent à nettoyer les surfaces des lames ainsi que les lames de recouvrement et à les préparer à l’aminosilanisation. Une exigence critique pour mener des expériences de fluorescence à molécule unique sur des molécules attachées à la surface est u...

<ol>
	<li>Smock, R. G., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sending+signals+dynamically.">Sending signals dynamically.</a> Science. 324 (5924), 198-203 (2009).</li><li>Changeux, J. P., Christopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulation+as+a+unifying+mechanism+for+receptor+function+and+regulation.">Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation.</a> Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).</li><li>Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+G+protein-coupled+receptors+(GPCRs):+biological+functions+and+potential+drug+targets.">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).</li><li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+&#946;2+adrenergic+receptor.">Conformational changes in the G protein Gs induced by the &#946;2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).</li><li>Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+a+class+C+G-protein-coupled+receptor.">Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).</li><li>Niswender, C. M., Conn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors:+Physiology,+pharmacology,+and+disease.">Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).</li><li>Pin, J. P., Bettler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+functions+of+mGlu+and+GABA(B)+receptor+complexes.">Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes.</a> Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).</li><li>Kniazeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed+state+of+both+binding+domains+of+homodimeric+mGlu+receptors+is+required+for+full+activity.">Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).</li><li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+rearrangement+during+activation+of+a+metabotropic+glutamate+receptor.">Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor.</a> Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).</li><li>Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+site-specific+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins.">A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins.</a> Science. 244 (4901), 182-188 (1989).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation.">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+mutagenesis+of+GPCRs+using+amber+codon+suppression+and+bioorthogonal+labeling.">Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling.</a> G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).</li><li>Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Four+-+Incorporation+of+Unnatural+Amino+Acids+into+Proteins+Expressed+in+Mammalian+Cells.">Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells.</a> Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent.">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+short+chain+nonionic+detergents+destabilize+G-protein-coupled+receptors.">How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).</li><li>Cao, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+enhance+agonist+efficacy+by+increasing+the+residence+time+of+a+GPCR+in+the+active+state.">Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).</li><li>Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cross-correlation+filtering+of+one-and+two-color+single+molecule+localization+microscopy+data.">Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data.</a> Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).</li><li>Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+locus+specific+chromatin+structure+and+dynamics+with+correlative+conventional+and+super-resolution+imaging+in+living+cells.">Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+FRET+efficiency+and+ratio+of+donor+to+acceptor+concentration+in+living+cells.">Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells.</a> Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).</li><li>Gopich, I. V., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+efficiency+distributions+of+multistate+single+molecules.">FRET efficiency distributions of multistate single molecules.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-A+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series:+A+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data.">Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+structural+elements+of+the+T-box+riboswitch+drive+the+two-step+binding+of+the+tRNA+ligand.">Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand.</a> Elife. 7, 39518 (2018).</li><li>Goodman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+based+on+a+certain+multivariate+complex+Gaussian+distribution+(an+introduction).">Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction).</a> The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).</li><li>Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sensitivity+modulation+in+the+calcium-sensing+receptor+via+electrostatic+tuning.">Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning.</a> Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).</li><li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions.">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li><li>Huang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+conformational+landscape+of+the+adenosine+A(2A)+receptor+during+G+protein+coupling.">Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling.</a> Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).</li><li>Wingler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+analogs+with+divergent+bias+stabilize+distinct+receptor+conformations.">Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations.</a> Cell. 176 (3), 468-478 (2019).</li><li>Gordon, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+of+biarylazacyclooctynones+in+copper-free+click+chemistry.">Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).</li><li>Kim, E., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+copper-free+click+chemistry:+In+vitro,+in+vivo,+and+ex+vivo.">Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo.</a> Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).</li><li>Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations,+challenges,+and+limitations+of+bioconjugation+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ligand+activation+in+human+calcium-sensing+receptor.">Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor.</a> Elife. 5, 13662 (2016).</li></ol>

Les RCPG sont des protéines qui agissent sur la membrane cellulaire pour initier la transduction du signal. De nombreux RCPG se composent de plusieurs domaines, la signalisation dépendant de l’interaction coopérative entre les domaines. Pour moduler les propriétés de ces récepteurs membranaires, il est essentiel de comprendre le comportement dynamique des multiples domaines. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) est une technique de fluorescence qui permet de mesure...

Le transfert d’informations à travers la membrane plasmique dépend fortement de la fonction des récepteurs membranaires1. La liaison du ligand à un récepteur entraîne un changement conformationnel et l’activation du récepteur. Ce processus est souvent de nature allostérique2. Avec plus de 800 membres, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires chez l’homme3. En raison de leur rôle dans presque tous les processus cellulaires, les RCPG sont devenus des cibles importantes pour le développement thérapeutique. Dans le modèle canonique de signalisation GPCR, l’activation agoniste entraîne des changements conformationnels du récepteur qui activent ensuite le complexe protéique G hétérotrimérique via l’échange de GDP contre GTP à la poche de liaison nucléotidique de Gα. Les sous-unités Gα-GTP et Gβγ activées contrôlent alors l’activité des protéines effectrices en aval et propagent la cascade de signalisation 4,5. Ce processus de signalisation dépend essentiellement de la capacité des ligands à modifier la forme tridimensionnelle du récepteur. Une compréhension mécaniste de la façon dont les ligands y parviennent est essentielle pour développer de nouvelles thérapies et concevoir des récepteurs et des capteurs synthétiques.
Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) font partie de la famille des RCPG de classe C et sont importants pour les effets neuromodulateurs lents du glutamate et le réglage de l’excitabilité neuronale 6,7. Parmi tous les RCPG, les RCPG de classe C sont structurellement uniques en ce sens qu’ils fonctionnent comme des dimères obligatoires. Les mGluR contiennent trois domaines structuraux : le domaine du piège à mouches de Vénus (VFT), le domaine riche en cystéine (CRD) et le domaine transmembranaire (TMD)8. Les changements conformationnels au cours du processus d’activation sont complexes et impliquent un couplage conformationnel local et global qui se propage sur une distance de 12 nm, ainsi que la coopérativité des dimères. Les conformations intermédiaires, l’ordre temporel des états et le taux de transition entre les états sont inconnus. En suivant la conformation des récepteurs individuels en temps réel, il est possible d’identifier les états intermédiaires transitoires et la séquence des changements conformationnels lors de l’activation. Ceci peut être réalisé en appliquant le transfert d’énergie de résonance de fluorescenceà molécule unique 9,10 (smFRET), comme cela a été récemment appliqué pour visualiser la propagation des changements conformationnels lors de l’activation de mGluR2 11. Une étape clé dans les expériences FRET est la génération de capteurs FRET par insertion spécifique au site des fluorophores donneurs et accepteurs dans la protéine d’intérêt. Une stratégie d’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) a été adoptée12,13,14,15 pour surmonter les limites des technologies typiques de marquage fluorescent spécifiques au site qui nécessitent la création de mutants sans cystéine ou l’insertion d’une grande étiquette génétiquement codée. Cela a permis d’observer le réarrangement conformationnel de l’essentiel liant allostérique, qui a rejoint les domaines de liaison et de signalisation du ligand de mGluR2. Dans ce protocole, un guide étape par étape pour effectuer des expériences smFRET sur mGluR2 est présenté, y compris l’approche pour le marquage spécifique au site de mGluR2 avec UAA pour fixer des fluorophores en utilisant la réaction de cyclisation de l’azoture catalysée par le cuivre. De plus, ce protocole décrit la méthodologie pour la capture directe des protéines membranaires et l’analyse des données. Le protocole décrit ici est également applicable à l’étude de la dynamique conformationnelle d’autres protéines membranaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>Cat # 06162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>548UAA</td>
			<td>Liauw et al. 2021</td>
			<td></td>
			<td>Transfected construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator (2022)</td>
			<td>https://www.adobe.com/</td>
			<td>RRID:SCR_010279</td>
			<td>Software, algorithm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminoguanidine (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>919-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator 2.8 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic Bath 2.8 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTTES</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1237-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 451657-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-306</td>
			<td>Sample chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Alkyne</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>TA117-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 Alkyne</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>TA116-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Part# D310 1 GM</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM-CHS (10:1)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Part# D310-CH210 1 ML</td>
			<td>Detergent with cholecterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di01-R405/488/561/635</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET542lp</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>Long pass emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF640-FDi01</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Emission dichroic filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-tag antibody</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>A01429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent bead</td>
			<td>Invitrogen T7279</td>
			<td>TetraSpeck microspheres</td>
			<td>Spherical bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>sample chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 6106-04-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 12022001</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FisherBioReagents</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Oxxius</td>
			<td></td>
			<td>4-line laser combiner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td></td>
			<td>Water Deionizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-PEG</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Item# MPEG-SIL-5000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF03-405/488/532/635</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985091</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM/Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro (2020b)</td>
			<td>https://www.originlab.com/</td>
			<td>RRID:SCR_014212</td>
			<td>Data analysis and graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIRE4-Azi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid # 105829</td>
			<td>Transfected construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>HWI group</td>
			<td>99-50-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smCamera (Version 1.0)</td>
			<td>http://ha.med.jhmi.edu/resources/</td>
			<td></td>
			<td>Camera software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>FisherBioReagents</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Whatman UNIFLO</td>
			<td>Cat#9914-2502</td>
			<td>Liquid filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53188-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the conformational dynamics of membrane receptors using single-molecule fret

La capacité des cellules à répondre aux signaux externes est essentielle au développement, à la croissance et à la survie cellulaires. Pour répondre à un signal de l’environnement, une cellule doit être capable de le reconnaître et de le traiter. Cette tâche repose principalement sur la fonction des récepteurs membranaires, dont le rôle est de convertir les signaux dans le langage biochimique de la cellule. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines réceptrices membranaires chez l’homme. Parmi les RCPG, les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) sont une sous-classe unique qui fonctionne comme dimères obligatoires et possède un grand domaine extracellulaire qui contient le site de liaison au ligand. Les progrès récents dans les études structurelles des mGluR ont amélioré la compréhension de leur processus d’activation. Cependant, la propagation de changements conformationnels à grande échelle par mGluR pendant l’activation et la modulation est mal comprise. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) est une technique puissante pour visualiser et quantifier la dynamique structurelle des biomolécules au niveau de la protéine unique. Pour visualiser le processus dynamique d’activation de mGluR2, des capteurs conformationnels fluorescents basés sur l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) ont été développés qui ont permis le marquage des protéines spécifiques au site sans perturbation de la structure native des récepteurs. Le protocole décrit ici explique comment effectuer ces expériences, y compris la nouvelle approche d’étiquetage UAA, la préparation des échantillons et l’acquisition et l’analyse des données smFRET. Ces stratégies sont généralisables et peuvent être étendues pour étudier la dynamique conformationnelle d’une variété de protéines membranaires.

Expression et marquage fluorescent d’un capteur FRET à base de SAU Ici, des résultats exemplaires de l’insertion et du marquage fluorescent d’un SAU (AZP) dans le CRD de mGluR2 (548UAA) sont discutés11. Comme mentionné précédemment, pour insérer AZP dans mGluR2, la co-expression de la machinerie translationnelle modifiée, qui comprend une synthétase d’ARNt modifiée et un ARNt complémentaire (pIRE4-Azi), et mGluR2 contenant un codon ambre en position 548, cré...

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Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

Cette étude présente une procédure détaillée pour effectuer des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) sur des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en utilisant un marquage spécifique au site via l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA). Le protocole fournit un guide étape par étape pour la préparation des échantillons smFRET, les expériences et l’analyse des données.

Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

Ici, nous avons utilisé le FRET à molécule unique et le marquage de protéines spécifiques au site via une incorporation naturelle d’acides aminés pour étudier la dynamique conformationnelle de mGluR2. Cela permet d’étudier la dynamique des protéines sans perturber la structure des protéines. La structure atomique fournit une image statique d’une protéine.Cependant, la molécule unique FRET nous permet de visualiser toute la gamme du mouvement des protéines en temps réel et en solution. Cette méthode peut être appliquée pour étudier la dynamique de n’importe quelle protéine. De plus, une incorporation naturelle d’acides aminés peut être utilisée pour étudier les interactions protéine-protéine et l’ingénierie des récepteurs synthétiques.Le chargement des échantillons et l’optimisation de l’imagerie nécessitent de la patience et de la pratique. Pour commencer, marquez les trous à percer sur la lame de verre avec un marqueur. Utilisez un Dremel pour percer de petits trous sur la glissière pendant que la glissière est plongée dans l’eau.Sonicer les lames et couvrir les lames d’acétone pendant 30 minutes dans un sonicateur de bain à 23 degrés Celsius. Jetez l’acétone de la lame et couvrez les bocaux. Rincer abondamment à l’eau et sonifier dans de l’hydroxyde de potassium à cinq molaires pendant 30 minutes.Ensuite, rincez les lames et couvrez le slip avec de l’eau, et soniquez dans le méthanol pendant deux minutes. Laissez les pots remplis de méthanol jusqu’à l’étape de salinisation amino. Verser le mélange de salinisation amino fraîchement préparé dans la lame et couvrir les bocaux.Incuber, sonifier et incuber à nouveau les lames et couvrir les lames dans un mélange de salinisation amino avant de jeter la solution. Ensuite, lavez les pots avec du méthanol avant de les remplir d’eau. Rincez ensuite les lames à l’eau.Séchez-les avec de l’air soufflé et placez-les dans les boîtes de montage. Appliquez 60 millilitres de solution de PEGylation sur la lame et placez un couvercle dessus. Marquez le côté non PEGylé avant le stockage.Après l’incubation, démonter doucement et rincer les lames et couvrir les lames avec de l’eau. Ensuite, séchez-les en soufflant de l’air et placez-les dans un tube stérile de 50 millilitres avec la surface PEGylée face à face. Après avoir passé les cellules HEK 293T avec 0,05% de trypsine-EDTA, ensemencer les cellules sur des lamelles de couverture de poly-L / D-lysine.Placer le milieu standard avec un milieu supplémenté en AZP pour les cellules en croissance et l’expression métabotropique du récepteur 2 du glutamate ou mGluR2. Ensuite, transfectez les cellules avec un réactif de transfection et incuber pendant 24 heures avant de changer le milieu avec un milieu frais supplémenté en AZP. 20 minutes avant l’étiquetage avec des colorants alcyne cyanine, lavez les feuillets de couverture deux fois avec un tampon d’enregistrement chaud, ou RB, et placez-les dans un support standard chaud sans AZP.Ensuite, retirez le support standard et lavez les cellules avec RB avant d’ajouter la solution d’étiquetage fraîchement préparée. Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Après l’incubation, retirez la solution d’étiquetage.Lavez deux fois avec le RB le bordereau de couvercle contenant les cellules transfectées et remettez en suspension dans le même milieu. Ensuite, enduisez les cellules en tournant à 1 000 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et retirez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 80 à 130 microlitres de la solution de lyse. Casser le granulé en le pipetant.Ensuite, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et placez-le sur la bascule à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure pour lyser les cellules. Enduire la fraction insoluble par centrifugation à 20 000 g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, transférez le surnageant dans un tube froid frais et stockez-le sur de la glace.Retirez la lame et le couvercle du congélateur et laissez-les chauffer à température ambiante dans l’obscurité. Assemblez la chambre en prenant en sandwich les bandes de ruban adhésif double face entre la glissière et le couvercle, en veillant à ce que les surfaces PEGylated forment l’intérieur de la chambre d’écoulement. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez sur le bordereau du couvercle pour vous assurer que le ruban entre en contact avec le bordereau et la glissière du couvercle.Appliquez de l’époxy sur les bords de la lame. Appliquez 40 microlitres de NeutrAvidine 500 nanomolaires sur chaque voie et incuber dans une boîte sombre humidifiée. Après deux minutes, lavez chaque voie de chambre avec 100 microlitres de tampon T50.Ajouter ensuite 20 nanomolaires solution d’anticorps biotinylés, et incuber pendant 30 minutes avant de laver avec 200 microlitres de tampon T50 par voie. Allumez l’ordinateur et le microscope. Allumez ensuite les lasers pour vous réchauffer.Ensuite, allumez la caméra EMCCD et ouvrez le logiciel. Montez la chambre d’échantillonnage sur la platine du microscope et ajoutez l’échantillon de protéines progressivement pour obtenir environ 400 molécules par champ de vision. Lavez la chambre avec 100 microlitres de tampon d’imagerie complété par 0,3 unité de protocatéchuate 3, 4-dioxygénase.Ajustez le gain, le taux d’acquisition et les puissances laser pour détecter les signaux de fluorescence d’une seule molécule dans les canaux donneur et accepteur. Ensuite, excitez le donneur, et acquérez des traces temporelles jusqu’à ce que 80% des molécules donneuses dans le champ de vision soient photoblanchies. À la fin du film, allumez le laser de 640 nanomètres pour exciter directement l’accepteur jusqu’à ce que certaines molécules soient photoblanchies.Changez le champ de vision et répétez les étapes pour excitation du donneur et de l’accepteur afin de collecter trois films par condition. Pour sélectionner des traces FRET à molécule unique de prélèvement de particules, sélectionnez les traces où l’intensité totale des traces donneuses et accepteuses est stable dans le temps. Sélectionnez ensuite les traces avec des changements anti-corrélés dans les intensités donneur et accepteur.Sélectionnez les molécules donneuses et acceptrices montrant un photoblanchiment en une seule étape et des traces de plus de cinq secondes. Calculez le déficit FRET. Enfin, identifiez l’état conformationnel par modélisation de Markov cachée, ou HMM, en suivant les étapes décrites dans le manuscrit.Le marquage de l’AZP par des colorants cyanine a été réalisé par une réaction de cycloaddition catalysée par le cuivre et a abouti à un marquage efficace de la membrane plasmique de 548UAA avec la population de surface cellulaire marquée avec des fluorophores donneurs et acceptants. Dans l’électrophorèse SDS-PAGE, une seule bande à 250 kilodaltons a été observée dans les cellules HEK 293T exprimant 548UAA, ce qui coïncidait avec le dimère pleine longueur mGluR2. Des traces sélectives représentatives pour de multiples événements de blanchiment de courte durée et de longue durée pour donneurs et accepteurs sont présentées ici.Les états conformationnels ont été identifiés à l’aide de l’analyse HMM. Les transitions entre les états FRET discrets ont été extraites des ajustements idéalisés et tracées sous la forme d’une carte thermique de densité de transition. Les traces FRET idéalisées fournissent également des informations sur le temps de séjour pour chaque confirmation identifiée.Les traces de la molécule unique avec le canal donneur et accepteur sont montrées ici. De plus, la molécule unique FRET révèle quatre états conformationnels du domaine riche en cystéine mGluR2. Une préservation efficace des pics est essentielle à l’extraction d’une seule molécule, et des précautions doivent être prises pendant ce processus.De plus, l’agent piégeur d’oxygène doit être ajouté immédiatement avant l’imagerie. Cette méthode de marquage et les expériences FRET à molécule unique ont été appliquées à plusieurs récepteurs et ont fourni de nouvelles informations sur le mécanisme d’activation des récepteurs et la modulation de la fonction des récepteurs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Recherche

Biochimie

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Information sur la structure à partir d&#39;une seule molécule FRET expériences utilisant la Nano-positionnement Système rapide

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulation de molécules simples de G-quadruplexes par pinces magnétiques

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Immobilisation covalente de protéines pour la spectroscopie de Force seule molécule

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...