Name: visualizing the conformational dynamics of membrane receptors using single-molecule fret
Uploaded: 2022-08-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET at JoVE.com

Ringraziamo i membri del laboratorio Reza Vafabakhsh per le discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione R01GM140272 del National Institutes of Health (a R.V.), dal Searle Leadership Fund for the Life Sciences della Northwestern University e dal Chicago Biomedical Consortium con il supporto dei Searle Funds del Chicago Community Trust (a R.V.). B.W.L. è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

Il flusso di lavoro complessivo del protocollo è descritto nella Figura 1.
1. Preparazione della camera di campionamento
<ol><li>Pulizia vetrini e coprivetrini NOTA: Questi passaggi mirano a pulire le superfici dei vetrini e dei vetrini e prepararli per l'aminosilanizzazione. Un requisito critico per condurre esperimenti di fluorescenza a singola molecola su molecole legate alla superficie è una superficie passivata. La tecnica di passivazione più affi...

<ol>
	<li>Smock, R. G., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sending+signals+dynamically.">Sending signals dynamically.</a> Science. 324 (5924), 198-203 (2009).</li><li>Changeux, J. P., Christopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulation+as+a+unifying+mechanism+for+receptor+function+and+regulation.">Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation.</a> Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).</li><li>Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+G+protein-coupled+receptors+(GPCRs):+biological+functions+and+potential+drug+targets.">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).</li><li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+&#946;2+adrenergic+receptor.">Conformational changes in the G protein Gs induced by the &#946;2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).</li><li>Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+a+class+C+G-protein-coupled+receptor.">Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).</li><li>Niswender, C. M., Conn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors:+Physiology,+pharmacology,+and+disease.">Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).</li><li>Pin, J. P., Bettler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+functions+of+mGlu+and+GABA(B)+receptor+complexes.">Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes.</a> Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).</li><li>Kniazeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed+state+of+both+binding+domains+of+homodimeric+mGlu+receptors+is+required+for+full+activity.">Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).</li><li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+rearrangement+during+activation+of+a+metabotropic+glutamate+receptor.">Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor.</a> Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).</li><li>Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+site-specific+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins.">A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins.</a> Science. 244 (4901), 182-188 (1989).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation.">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+mutagenesis+of+GPCRs+using+amber+codon+suppression+and+bioorthogonal+labeling.">Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling.</a> G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).</li><li>Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Four+-+Incorporation+of+Unnatural+Amino+Acids+into+Proteins+Expressed+in+Mammalian+Cells.">Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells.</a> Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent.">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+short+chain+nonionic+detergents+destabilize+G-protein-coupled+receptors.">How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).</li><li>Cao, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+enhance+agonist+efficacy+by+increasing+the+residence+time+of+a+GPCR+in+the+active+state.">Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).</li><li>Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cross-correlation+filtering+of+one-and+two-color+single+molecule+localization+microscopy+data.">Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data.</a> Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).</li><li>Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+locus+specific+chromatin+structure+and+dynamics+with+correlative+conventional+and+super-resolution+imaging+in+living+cells.">Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+FRET+efficiency+and+ratio+of+donor+to+acceptor+concentration+in+living+cells.">Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells.</a> Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).</li><li>Gopich, I. V., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+efficiency+distributions+of+multistate+single+molecules.">FRET efficiency distributions of multistate single molecules.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-A+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series:+A+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data.">Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+structural+elements+of+the+T-box+riboswitch+drive+the+two-step+binding+of+the+tRNA+ligand.">Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand.</a> Elife. 7, 39518 (2018).</li><li>Goodman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+based+on+a+certain+multivariate+complex+Gaussian+distribution+(an+introduction).">Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction).</a> The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).</li><li>Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sensitivity+modulation+in+the+calcium-sensing+receptor+via+electrostatic+tuning.">Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning.</a> Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).</li><li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions.">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li><li>Huang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+conformational+landscape+of+the+adenosine+A(2A)+receptor+during+G+protein+coupling.">Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling.</a> Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).</li><li>Wingler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+analogs+with+divergent+bias+stabilize+distinct+receptor+conformations.">Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations.</a> Cell. 176 (3), 468-478 (2019).</li><li>Gordon, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+of+biarylazacyclooctynones+in+copper-free+click+chemistry.">Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).</li><li>Kim, E., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+copper-free+click+chemistry:+In+vitro,+in+vivo,+and+ex+vivo.">Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo.</a> Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).</li><li>Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations,+challenges,+and+limitations+of+bioconjugation+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ligand+activation+in+human+calcium-sensing+receptor.">Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor.</a> Elife. 5, 13662 (2016).</li></ol>

I GPCR sono proteine che operano sulla membrana cellulare per avviare la trasduzione del segnale. Molti GPCR sono costituiti da più domini, con la segnalazione dipendente dall'interazione cooperativa tra i domini. Per modulare le proprietà di questi recettori di membrana, è essenziale comprendere il comportamento dinamico dei molteplici domini. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica di fluorescenza che consente la misurazione della conformazione e della dina...

Il trasferimento di informazioni attraverso la membrana plasmatica dipende fortemente dalla funzione dei recettori di membrana1. Il legame del ligando a un recettore porta a un cambiamento conformazionale e all'attivazione del recettore. Questo processo è spesso di natura allosterica2. Con oltre 800 membri, i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono la più grande famiglia di recettori di membrana nell'uomo3. A causa del loro ruolo in quasi tutti i processi cellulari, i GPCR sono diventati obiettivi importanti per lo sviluppo terapeutico. Nel modello canonico di segnalazione GPCR, l'attivazione agonista provoca cambiamenti conformazionali del recettore che successivamente attivano il complesso della proteina G eterotrimerica attraverso lo scambio di GDP per GTP nella tasca di legame nucleotidico di Gα. Le subunità G α-GTP e Gβγ attivate controllano quindi l'attività delle proteine effettrici a valle e propagano la cascata di segnalazione 4,5. Questo processo di segnalazione dipende essenzialmente dalla capacità dei ligandi di cambiare la forma tridimensionale del recettore. Una comprensione meccanicistica di come i ligandi raggiungono questo obiettivo è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie e la progettazione di recettori e sensori sintetici.
I recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono membri della famiglia GPCR di classe C e sono importanti per gli effetti neuromodulatori lenti del glutammato e per la sintonizzazione dell'eccitabilità neuronale 6,7. Tra tutti i GPCR, i GPCR di classe C sono strutturalmente unici in quanto funzionano come dimeri obbligati. mGluR contiene tre domini strutturali: il dominio Venere acchiappamosche (VFT), il dominio ricco di cisteina (CRD) e il dominio transmembrana (TMD)8. I cambiamenti conformazionali durante il processo di attivazione sono complessi e coinvolgono l'accoppiamento conformazionale locale e globale che si propaga su una distanza di 12 nm, così come la cooperatività del dimero. Le conformazioni intermedie, l'ordinamento temporale degli stati e il tasso di transizione tra gli stati sono sconosciuti. Seguendo in tempo reale la conformazione dei singoli recettori è possibile individuare gli stati intermedi transitori e la sequenza dei cambiamenti conformazionali durante l'attivazione. Questo può essere ottenuto applicando il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola 9,10 (smFRET), come è stato recentemente applicato per visualizzare la propagazione dei cambiamenti conformazionali durante l'attivazione di mGluR2 11. Un passo fondamentale negli esperimenti FRET è la generazione di sensori FRET mediante inserimento sito-specifico dei fluorofori donatori e accettori nella proteina di interesse. Una strategia di incorporazione di aminoacidi innaturali (UAA) è stata adottata12,13,14,15 per superare i limiti delle tipiche tecnologie di etichettatura fluorescente sito-specifiche che richiedono la creazione di mutanti senza cisteina o l'inserimento di un grande tag geneticamente codificato. Ciò ha permesso di osservare il riarrangiamento conformazionale dell'essenziale linker allosterico compatto, che si univa ai domini di legame e segnalazione del ligando di mGluR2. In questo protocollo, viene presentata una guida passo-passo per eseguire esperimenti smFRET su mGluR2, incluso l'approccio per l'etichettatura sito-specifica di mGluR2 con UAA per attaccare fluorofori utilizzando la reazione di ciclizzazione dell'azide catalizzata dal rame. Inoltre, questo protocollo descrive la metodologia per la cattura diretta delle proteine di membrana e l'analisi dei dati. Il protocollo qui delineato è applicabile anche allo studio della dinamica conformazionale di altre proteine di membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>Cat # 06162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>548UAA</td>
			<td>Liauw et al. 2021</td>
			<td></td>
			<td>Transfected construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator (2022)</td>
			<td>https://www.adobe.com/</td>
			<td>RRID:SCR_010279</td>
			<td>Software, algorithm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminoguanidine (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>919-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator 2.8 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic Bath 2.8 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTTES</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1237-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 451657-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-306</td>
			<td>Sample chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Alkyne</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>TA117-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 Alkyne</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>TA116-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Part# D310 1 GM</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM-CHS (10:1)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Part# D310-CH210 1 ML</td>
			<td>Detergent with cholecterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di01-R405/488/561/635</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET542lp</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>Long pass emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF640-FDi01</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Emission dichroic filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-tag antibody</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>A01429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent bead</td>
			<td>Invitrogen T7279</td>
			<td>TetraSpeck microspheres</td>
			<td>Spherical bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>sample chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 6106-04-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 12022001</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FisherBioReagents</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Oxxius</td>
			<td></td>
			<td>4-line laser combiner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td></td>
			<td>Water Deionizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-PEG</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Item# MPEG-SIL-5000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF03-405/488/532/635</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985091</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM/Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro (2020b)</td>
			<td>https://www.originlab.com/</td>
			<td>RRID:SCR_014212</td>
			<td>Data analysis and graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIRE4-Azi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid # 105829</td>
			<td>Transfected construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>HWI group</td>
			<td>99-50-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smCamera (Version 1.0)</td>
			<td>http://ha.med.jhmi.edu/resources/</td>
			<td></td>
			<td>Camera software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>FisherBioReagents</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Whatman UNIFLO</td>
			<td>Cat#9914-2502</td>
			<td>Liquid filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53188-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the conformational dynamics of membrane receptors using single-molecule fret

La capacità delle cellule di rispondere ai segnali esterni è essenziale per lo sviluppo, la crescita e la sopravvivenza cellulare. Per rispondere a un segnale proveniente dall'ambiente, una cellula deve essere in grado di riconoscerlo ed elaborarlo. Questo compito si basa principalmente sulla funzione dei recettori di membrana, il cui ruolo è quello di convertire i segnali nel linguaggio biochimico della cellula. I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande famiglia di proteine recettoriali di membrana nell'uomo. Tra i GPCR, i recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono una sottoclasse unica che funziona come dimeri obbligati e possiede un ampio dominio extracellulare che contiene il sito di legame del ligando. I recenti progressi negli studi strutturali dei mGluR hanno migliorato la comprensione del loro processo di attivazione. Tuttavia, la propagazione di cambiamenti conformazionali su larga scala attraverso mGluR durante l'attivazione e la modulazione è poco conosciuta. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica potente per visualizzare e quantificare la dinamica strutturale delle biomolecole a livello di singola proteina. Per visualizzare il processo dinamico di attivazione di mGluR2, sono stati sviluppati sensori conformazionali fluorescenti basati sull'incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA) che hanno permesso la marcatura proteica sito-specifica senza perturbazioni della struttura nativa dei recettori. Il protocollo qui descritto spiega come eseguire questi esperimenti, incluso il nuovo approccio di etichettatura UAA, la preparazione del campione e l'acquisizione e l'analisi dei dati smFRET. Queste strategie sono generalizzabili e possono essere estese per studiare le dinamiche conformazionali di una varietà di proteine di membrana.

Espressione ed etichettatura fluorescente di sensori FRET basati su UAA Quivengono discussi i risultati esemplari dell'inserimento e dell'etichettatura fluorescente di una UAA (AZP) all'interno del CRD di mGluR2 (548UAA). Come accennato in precedenza, per inserire AZP in mGluR2, è necessaria la co-espressione del macchinario traslazionale ingegnerizzato, che include una tRNA sintetasi modificata e tRNA complementare (pIRE4-Azi), e mGluR2 contenente un codone ambrato in posizio...

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Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

Questo studio presenta una procedura dettagliata per eseguire esperimenti di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) sui recettori accoppiati a proteine G (GPCR) utilizzando la marcatura sito-specifica tramite incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA). Il protocollo fornisce una guida passo-passo per la preparazione dei campioni smFRET, gli esperimenti e l'analisi dei dati.

Visualizzazione della dinamica conformazionale dei recettori di membrana utilizzando FRET a singola molecola

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

Qui, abbiamo usato FRET a singola molecola e marcatura proteica sito-specifica tramite un'incorporazione naturale di amminoacidi per studiare la dinamica conformazionale di mGluR2. Questo permette di studiare la dinamica delle proteine senza perturbare la struttura proteica. La struttura atomica fornisce un'immagine statica di una proteina.Tuttavia, la FRET a singola molecola ci consente di visualizzare l'intera gamma di movimento delle proteine in tempo reale e in soluzione. Questo metodo può essere applicato per studiare la dinamica di qualsiasi proteina. Inoltre, un'incorporazione naturale di aminoacidi può essere utilizzata per studiare le interazioni proteina-proteina e l'ingegneria dei recettori sintetici.Il caricamento dei campioni e l'ottimizzazione dell'imaging richiedono pazienza e pratica. Per iniziare, segnare i fori da praticare sul vetrino con un pennarello. Utilizzare un Dremel per praticare piccoli fori sulla diapositiva mentre il vetrino è immerso nell'acqua.Sonicare i vetrini e coprire le scivolate in acetone per 30 minuti in un sonicatore da bagno a 23 gradi Celsius. Smaltire l'acetone dal vetrino e coprire i barattoli. Risciacquare abbondantemente con acqua e sonicare in idrossido di potassio a cinque molari per 30 minuti.Quindi, sciacquare i vetrini e coprire lo scivolo con acqua e sonicare in metanolo per due minuti. Lasciare i vasetti pieni di metanolo fino alla fase di salinizzazione dell'ammino. Versare la miscela di amminosalinizzazione appena preparata nel vetrino e coprire i barattoli.Incubare, sonicare e nuovamente incubare i vetrini e i vetrini di copertura in una miscela di amminosalinizzazione prima di scartare la soluzione. Quindi, lavare i barattoli con metanolo prima di riempirli d'acqua. Quindi sciacquare i vetrini con acqua.Asciugarli con un colpo d'aria e posizionarli nelle scatole di assemblaggio. Applicare 60 millilitri di soluzione di PEGylation sul vetrino e posizionare un vetrino di copertura sopra di esso. Contrassegnare il lato non PEGilato prima di riporlo.Dopo l'incubazione, smontare delicatamente e sciacquare i vetrini e coprire gli slip con acqua. Quindi asciugarli soffiando aria e metterli in un tubo sterile da 50 millilitri con la superficie PEGilata rivolta l'una verso l'altra. Dopo aver passato le cellule HEK 293T con 0,05% tripsina-EDTA, seminare le cellule su poli-L / D-lisina vetrini di copertura.Posizionare i terreni standard con AZP integrato per le cellule in crescita e il recettore metabotropico del glutammato 2 o l'espressione di mGluR2. Quindi trasfettare le cellule con un reagente di trasfezione e incubare per 24 ore prima di cambiare il terreno con nuovi mezzi integrati con AZP. 20 minuti prima dell'etichettatura con coloranti alchinicianici, lavare due volte i vetrini di copertina con Recording Buffer caldo, o RB, e metterli in un supporto standard caldo senza AZP.Quindi rimuovere il supporto standard e lavare le celle con RB prima di aggiungere la soluzione di etichettatura appena preparata. Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di etichettatura.Lavare due volte con il RB il vetrino contenente le cellule trasfettate e risospendere nello stesso mezzo. Quindi, pellettare le cellule ruotando a 1.000 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti e rimuovere il surnatante prima di sospendere nuovamente il pellet in 80-130 microlitri della soluzione di lisi. Rompere il pellet mediante pipettaggio.Quindi avvolgerlo in un foglio e posizionarlo sul bilanciere a quattro gradi Celsius per 30 minuti a un'ora per lisare le cellule. Pellettare la frazione insolubile mediante centrifugazione a 20.000 g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Quindi trasferire il surnatante in un tubo freddo fresco e conservarlo sul ghiaccio.Rimuovere il vetrino e il coperchio dal congelatore e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente al buio. Assemblare la camera inserendo le strisce di nastro biadesivo tra la slitta e la slitta di copertura, assicurandosi che le superfici PEGilate formino l'interno della camera di flusso. Utilizzando una punta per pipetta, premere il vetrino di copertina per assicurarsi che il nastro entri in contatto con il vetrino e lo scorrimento.Applicare resina epossidica ai bordi della diapositiva. Applicare 40 microlitri di NeutrAvidin da 500 nanomolari su ciascuna corsia e incubare all'interno di una scatola scura umidificata. Dopo due minuti, lavare ogni corsia della camera con 100 microlitri di tampone T50.Quindi aggiungere 20 soluzioni di anticorpi biotinilati nanomolari e incubare per 30 minuti prima di lavare con 200 microlitri di tampone T50 per corsia. Accendere il computer e il microscopio. Quindi accendere i laser per riscaldarsi.Quindi, accendi la videocamera EMCCD e apri il software. Montare la camera del campione sullo stadio del microscopio e aggiungere gradualmente il campione proteico per ottenere circa 400 molecole per campo visivo. Lavare la camera con 100 microlitri di tampone di imaging integrato con 0,3 unità di protocatechuate 3, 4-diossigenasi.Regolare il guadagno, la velocità di acquisizione e le potenze del laser per rilevare segnali di fluorescenza a singola molecola sia nel canale donatore che in quello di accettazione. Quindi eccitare il donatore e acquisire tracce temporali fino a quando l'80% delle molecole del donatore nel campo visivo sono fotosbiancate. Alla fine del film, accendi il laser a 640 nanometri per eccitare direttamente l'accettore fino a quando alcune delle molecole non vengono fotosbiancate.Modificare il campo visivo e ripetere i passaggi per l'eccitazione del donatore e dell'accettatore per raccogliere tre filmati per condizione. Per selezionare tracce FRET a singola molecola di prelievo di particelle, selezionare le tracce in cui l'intensità totale delle tracce del donatore e dell'accettore è stabile nel tempo. Quindi selezionare le tracce con cambiamenti anti-correlati nelle intensità del donatore e dell'accettore.Selezionare le molecole donatrici e accettanti che mostrano il fotosbiancamento in un'unica fase e tracce lunghe più di cinque secondi. Calcola la carenza di FRET. Infine, identificare lo stato conformazionale mediante Hidden Markov Modeling, o HMM, seguendo i passaggi descritti nel manoscritto.La marcatura di AZP mediante coloranti di cianina è stata ottenuta mediante una reazione di cicloaddizione catalizzata dal rame e ha portato a un'efficace marcatura della membrana plasmatica di 548UAA con la popolazione di superficie cellulare marcata con fluorofori donatori e accettori. Nell'elettroforesi SDS-PAGE, è stata osservata una singola banda a 250 kilodalton nelle cellule HEK 293T che esprimono 548UAA, che ha coinciso con il dimerico a lunghezza intera mGluR2. Qui sono mostrate tracce selettive rappresentative per più eventi di sbiancamento di breve durata e di lunga durata per donatori e accettanti.Gli stati conformazionali sono stati identificati utilizzando l'analisi HMM. Le transizioni tra stati FRET discreti sono state estratte dagli adattamenti idealizzati e tracciate come una mappa di calore della densità di transizione. Le tracce FRET idealizzate forniscono anche informazioni sul tempo di permanenza per ogni conferma identificata.Le tracce della singola molecola con il canale donatore e accettore sono mostrate qui. Inoltre, la singola molecola FRET rivela quattro stati conformazionali del dominio ricco di cisteina mGluR2. Un'efficiente conservazione del picco è essenziale per il pull-down di singole molecole e occorre prestare attenzione durante questo processo.Inoltre, l'agente di evacuazione dell'ossigeno deve essere aggiunto immediatamente prima dell'imaging. Questo metodo di etichettatura e gli esperimenti FRET a singola molecola sono stati applicati a più recettori e hanno fornito nuove informazioni sul meccanismo di attivazione dei recettori e sulla modulazione della funzione dei recettori.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Ricerca

Biochimica

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Informazioni strutturale da singola molecola di FRET esperimenti usando il Nano-Positioning System Veloce

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando tre colori singola molecola FRET per studiare la correlazione delle interazioni della proteina

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo