Name: visualizing the conformational dynamics of membrane receptors using single-molecule fret
Uploaded: 2022-08-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET at JoVE.com

議論してくれたReza Vafabakhshラボのメンバーに感謝します。この作業は、国立衛生研究所の助成金R01GM140272(R.V.へ)、ノースウェスタン大学の生命科学のためのサールリーダーシップ基金、およびシカゴコミュニティトラストのサール基金(R.V.へ)の支援を受けたシカゴ生物医学コンソーシアムによって支援されました。B.W.L.は、国立総合医学研究所(NIGMS)のトレーニング助成金T32GM-008061の支援を受けました。

プロトコルの全体的なワークフローを 図 1 に示します。
1.サンプルチャンバーの準備
<ol><li>スライドとカバーガラスのクリーニング 注意: これらの手順は、スライドの表面とカバーガラスを洗浄し、アミノシラン化の準備をすることを目的としています。表面テザー分子で単一分子蛍光実験を実施するための重要な要件の1つは、不動態化表?...

<ol>
	<li>Smock, R. G., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sending+signals+dynamically.">Sending signals dynamically.</a> Science. 324 (5924), 198-203 (2009).</li><li>Changeux, J. P., Christopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulation+as+a+unifying+mechanism+for+receptor+function+and+regulation.">Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation.</a> Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).</li><li>Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+G+protein-coupled+receptors+(GPCRs):+biological+functions+and+potential+drug+targets.">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).</li><li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+&#946;2+adrenergic+receptor.">Conformational changes in the G protein Gs induced by the &#946;2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).</li><li>Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+a+class+C+G-protein-coupled+receptor.">Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).</li><li>Niswender, C. M., Conn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors:+Physiology,+pharmacology,+and+disease.">Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).</li><li>Pin, J. P., Bettler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+functions+of+mGlu+and+GABA(B)+receptor+complexes.">Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes.</a> Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).</li><li>Kniazeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed+state+of+both+binding+domains+of+homodimeric+mGlu+receptors+is+required+for+full+activity.">Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).</li><li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+rearrangement+during+activation+of+a+metabotropic+glutamate+receptor.">Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor.</a> Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).</li><li>Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+site-specific+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins.">A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins.</a> Science. 244 (4901), 182-188 (1989).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation.">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+mutagenesis+of+GPCRs+using+amber+codon+suppression+and+bioorthogonal+labeling.">Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling.</a> G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).</li><li>Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Four+-+Incorporation+of+Unnatural+Amino+Acids+into+Proteins+Expressed+in+Mammalian+Cells.">Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells.</a> Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent.">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+short+chain+nonionic+detergents+destabilize+G-protein-coupled+receptors.">How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).</li><li>Cao, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+enhance+agonist+efficacy+by+increasing+the+residence+time+of+a+GPCR+in+the+active+state.">Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).</li><li>Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cross-correlation+filtering+of+one-and+two-color+single+molecule+localization+microscopy+data.">Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data.</a> Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).</li><li>Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+locus+specific+chromatin+structure+and+dynamics+with+correlative+conventional+and+super-resolution+imaging+in+living+cells.">Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+FRET+efficiency+and+ratio+of+donor+to+acceptor+concentration+in+living+cells.">Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells.</a> Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).</li><li>Gopich, I. V., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+efficiency+distributions+of+multistate+single+molecules.">FRET efficiency distributions of multistate single molecules.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-A+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series:+A+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data.">Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+structural+elements+of+the+T-box+riboswitch+drive+the+two-step+binding+of+the+tRNA+ligand.">Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand.</a> Elife. 7, 39518 (2018).</li><li>Goodman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+based+on+a+certain+multivariate+complex+Gaussian+distribution+(an+introduction).">Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction).</a> The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).</li><li>Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sensitivity+modulation+in+the+calcium-sensing+receptor+via+electrostatic+tuning.">Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning.</a> Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).</li><li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions.">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li><li>Huang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+conformational+landscape+of+the+adenosine+A(2A)+receptor+during+G+protein+coupling.">Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling.</a> Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).</li><li>Wingler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+analogs+with+divergent+bias+stabilize+distinct+receptor+conformations.">Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations.</a> Cell. 176 (3), 468-478 (2019).</li><li>Gordon, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+of+biarylazacyclooctynones+in+copper-free+click+chemistry.">Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).</li><li>Kim, E., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+copper-free+click+chemistry:+In+vitro,+in+vivo,+and+ex+vivo.">Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo.</a> Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).</li><li>Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations,+challenges,+and+limitations+of+bioconjugation+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ligand+activation+in+human+calcium-sensing+receptor.">Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor.</a> Elife. 5, 13662 (2016).</li></ol>

GPCRは、細胞膜上で作用してシグナル伝達を開始するタンパク質です。多くのGPCRは複数のドメインで構成されており、シグナリングはドメイン間の協調的相互作用に依存しています。これらの膜受容体の特性を調節するためには、複数のドメインの動的挙動を理解することが不可欠です。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)は、タンパク質の立体構造とダイナミクスをリアルタイムで測定...

原形質膜を横切る情報の伝達は、膜受容体の機能に大きく依存しています1。受容体へのリガンド結合は、立体構造変化および受容体活性化をもたらす。このプロセスは、本質的にアロステリックであることがよくあります2。800を超えるメンバーを持つGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜受容体の最大のファミリーです3。ほぼすべての細胞プロセスにおける役割により、GPCRは治療薬開発の重要な標的となっています。GPCRシグナル伝達の標準モデルでは、アゴニストの活性化は受容体の立体構造変化をもたらし、続いてGαのヌクレオチド結合ポケットでGDPとGTPの交換を介してヘテロ三量体Gタンパク質複合体を活性化します。活性化されたGα-GTPおよびGβγサブユニットは、下流のエフェクタータンパク質の活性を制御し、シグナル伝達カスケードを伝播します4,5。このシグナル伝達プロセスは、本質的に、受容体の三次元形状を変化させるリガンドの能力に依存する。リガンドがこれを達成する方法の機構的理解は、新しい治療法を開発し、合成受容体とセンサーを設計するために重要です。
代謝型グルタミン酸受容体(mGluRs)は、クラスC GPCRファミリーのメンバーであり、グルタミン酸の遅い神経調節効果とニューロンの興奮性を調整するために重要です6,7。すべてのGPCRの中で、クラスCのGPCRは、それらが絶対二量体として機能するという点で構造的に独特である。mGluRには、ハエトリソウ(VFT)ドメイン、システインリッチドメイン(CRD)、膜貫通ドメイン(TMD)の3つの構造ドメインが含まれています8。活性化プロセス中の立体配座変化は複雑であり、12 nmの距離にわたって伝播する局所的およびグローバルな立体配座結合、および二量体の協調性が含まれます。中間的な立体配座、状態の時間的秩序、状態間の遷移速度は不明です。個々の受容体の立体構造をリアルタイムで追跡することにより、活性化中の一過性の中間状態と立体構造変化のシーケンスを特定することができます。これは、mGluR2 11の活性化中の立体構造変化の伝播を視覚化するために最近適用されたように、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動9,10(smFRET)を適用することによって達成することができる。FRET実験の重要なステップは、目的のタンパク質にドナーおよびアクセプター蛍光色素を部位特異的に挿入することによるFRETセンサーの生成です。非天然アミノ酸(UAA)取り込み戦略が採用されました12,13,14,15システインレス変異体の作成または大きな遺伝的にコードされたタグの挿入を必要とする典型的な部位特異的蛍光標識技術の限界を克服するため。これにより、mGluR2のリガンド結合ドメインとシグナル伝達ドメインを結合した必須のコンパクトなアロステリックリンカーの立体構造再配列を観察することができました。このプロトコルでは、銅触媒によるアジ化環化反応を用いて蛍光色素を結合させるためのUAAによるmGluR2の部位特異的標識のアプローチなど、mGluR2でsmFRET実験を行うためのステップバイステップガイドを紹介します。さらに、このプロトコルは、膜タンパク質の直接捕捉およびデータ解析のための方法論を記述する。ここで概説したプロトコルは、他の膜タンパク質の立体構造ダイナミクスの研究にも適用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>Cat # 06162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>548UAA</td>
			<td>Liauw et al. 2021</td>
			<td></td>
			<td>Transfected construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator (2022)</td>
			<td>https://www.adobe.com/</td>
			<td>RRID:SCR_010279</td>
			<td>Software, algorithm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminoguanidine (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>919-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator 2.8 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic Bath 2.8 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTTES</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1237-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 451657-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-306</td>
			<td>Sample chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Alkyne</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>TA117-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 Alkyne</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>TA116-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Part# D310 1 GM</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM-CHS (10:1)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Part# D310-CH210 1 ML</td>
			<td>Detergent with cholecterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di01-R405/488/561/635</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET542lp</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>Long pass emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF640-FDi01</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Emission dichroic filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-tag antibody</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>A01429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent bead</td>
			<td>Invitrogen T7279</td>
			<td>TetraSpeck microspheres</td>
			<td>Spherical bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>sample chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 6106-04-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 12022001</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FisherBioReagents</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Oxxius</td>
			<td></td>
			<td>4-line laser combiner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td></td>
			<td>Water Deionizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-PEG</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Item# MPEG-SIL-5000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF03-405/488/532/635</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985091</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM/Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro (2020b)</td>
			<td>https://www.originlab.com/</td>
			<td>RRID:SCR_014212</td>
			<td>Data analysis and graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIRE4-Azi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid # 105829</td>
			<td>Transfected construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>HWI group</td>
			<td>99-50-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smCamera (Version 1.0)</td>
			<td>http://ha.med.jhmi.edu/resources/</td>
			<td></td>
			<td>Camera software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>FisherBioReagents</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Whatman UNIFLO</td>
			<td>Cat#9914-2502</td>
			<td>Liquid filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53188-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the conformational dynamics of membrane receptors using single-molecule fret

細胞が外部シグナルに応答する能力は、細胞の発生、成長、および生存に不可欠です。環境からの信号に応答するには、細胞がそれを認識して処理できなければなりません。この課題は主に膜受容体の機能に依存しており、その役割はシグナルを細胞の生化学的言語に変換することである。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜受容体タンパク質の最大のファミリーを構成しています。GPCRの中でも、代謝型グルタミン酸受容体(mGluRs)は、絶対二量体として機能し、リガンド結合部位を含む大きな細胞外ドメインを有するユニークなサブクラスです。mGluRの構造研究における最近の進歩は、それらの活性化過程の理解を改善しました。しかし、活性化および調節中のmGluRを介した大規模な立体配座変化の伝播はよくわかっていません。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)は、生体分子の構造ダイナミクスを単一タンパク質レベルで視覚化および定量化するための強力な手法です。mGluR2活性化の動的プロセスを視覚化するために、非天然アミノ酸(UAA)の取り込みに基づく蛍光立体配座センサーが開発され、受容体の天然構造の摂動なしに部位特異的タンパク質標識が可能になりました。ここで説明するプロトコルでは、新しいUAAラベリングアプローチ、サンプル調製、smFRETデータの取得と分析など、これらの実験の実行方法について説明します。これらの戦略は一般化可能であり、さまざまな膜タンパク質の立体構造ダイナミクスを調べるために拡張することができます。

UAAベースのFRETセンサーの発現と蛍光標識 本明細書では、mGluR2(548UAA)のCRD内へのUAA(AZP)の挿入および蛍光標識の例示的な結果が考察される11。前述のように、AZPをmGluR2に挿入するには、改変tRNA合成酵素と相補的tRNA(pIRE4-Azi)を含む改変翻訳機構と、突然変異誘発法を用いて作成された548位のアンバーコドンを含むmGluR2の共発現が必要です(図2A</strong...

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Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

この研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)実験を実行するための詳細な手順を示します 非天然アミノ酸(UAA)の取り込み による 部位特異的標識を使用します。このプロトコルは、smFRETサンプル調製、実験、およびデータ分析のためのステップバイステップガイドを提供します。

1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

ここでは、単一分子FRETを使用し、天然アミノ酸の取り込みを介した部位特異的タンパク質標識を使用して、mGluR2の構造動態を研究しました。これにより、タンパク質構造を乱すことなくタンパク質動態を研究することができます。原子構造は、タンパク質の静止画像を提供する。しかし、1分子FRETを使用すると、タンパク質の全範囲の動きをリアルタイムで溶液で視覚化できます。この方法は、あらゆるタンパク質の動態を研究するために適用することができる。さらに、天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質間相互作用、および合成受容体の工学を研究するために使用することができる。サンプルのローディングとイメージングの最適化には、忍耐と練習が必要です。まず、スライドガラスに開ける穴にマーカーで印を付けます。スライドを水に浸している間、ドレメルを使用してスライドに小さな穴を開けます。スライドを超音波処理し、摂氏23度のバス超音波処理器で30分間アセトンでスリップを覆います。スライドとカバーのスリップジャーからアセトンを廃棄します。水で十分にすすぎ、5モル水酸化カリウムで30分間超音波処理します。次に、スライドをすすぎ、スリップを水で覆い、メタノール中で2分間超音波処理します。アミノ塩類化ステップまでメタノールで満たされたジャーを残します。新しく調製したアミノ塩類化混合物をスライドに注ぎ、スリップジャーを覆います。溶液を廃棄する前に、アミノ塩類化混合物中のスライドおよびカバースリップをインキュベートし、超音波処理し、再びインキュベートする。次に、瓶を水で満たす前にメタノールで洗います。次に、スライドを水ですすいでください。エアブローで乾かし、組み立てボックスに入れます。60ミリリットルのPEG化溶液をスライドに塗布し、その上にカバースリップを置きます。保管する前に、非PEG化面に印を付けてください。インキュベーション後、静かに分解し、スライドとカバースリップを水ですすいでください。次に、空気を吹き付けて乾燥させ、PEG化表面を互いに反対側に向けて滅菌した50ミリリットルのチューブに入れます。HEK 293T細胞を0.05%トリプシン-EDTAで継代した後、細胞をポリ-L/D-リジンカバースリップに播種します。増殖細胞および代謝型グルタミン酸受容体2、またはmGluR2発現用のAZP補充培地を含む標準培地を配置する。その後、トランスフェクション試薬で細胞をトランスフェクションし、24時間インキュベートしてから、新鮮なAZP添加培地で培地を交換します。アルキンシアニン染料で標識する20分前に、カバースリップを温かい記録バッファー(RB)で2回洗浄し、AZPを含まない温かい標準培地に入れます。次に、標準培地を除去し、細胞をRBで洗浄してから、新たに調製した標識溶液を加えます。暗闇の中で摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、標識溶液を取り除きます。トランスフェクトした細胞を含むカバースリップをRBで2回洗浄し、同じ培地に再懸濁します。次に、摂氏4度で1,000gで5分間回転させて細胞をペレット化し、上清を除去してからペレットを80〜130マイクロリットルの溶解溶液に再懸濁した。ピペッティングでペレットを破る。次に、それをホイルで包み、摂氏4度のロッカーに30分から1時間置き、細胞を溶解します。不溶性画分を20, 000 gおよび摂氏4度で20分間遠心分離することによりペレット化する。次に、上清を新鮮な冷たいチューブに移し、氷の上に保存します。スライドとカバースリップを冷凍庫から取り出し、暗所で室温で温めます。スライドとカバースリップの間に両面テープのストリップを挟んでチャンバーを組み立て、PEG化表面がフローチャンバーの内部を形成するようにします。ピペットチップを使用してカバースリップを押し、テープがカバースリップとスライドに接触していることを確認します。スライドの端にエポキシを塗布します。40マイクロリットルの500ナノモルのニュートラアビジンを各レーンに塗布し、加湿した暗い箱の中でインキュベートします。2分後、各チャンバーレーンを100マイクロリットルのT50バッファーで洗浄します。次に、20ナノモルのビオチン化抗体溶液を加え、レーンあたり200マイクロリットルのT50バッファーで洗浄する前に30分間インキュベートします。コンピュータと顕微鏡の電源を入れます。次に、レーザーをオンにしてウォームアップします。次に、EMCCDカメラの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。サンプルチャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、タンパク質サンプルを徐々に追加して、視野あたり約400分子を実現します。0.3単位のプロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼを添加した100マイクロリットルのイメージングバッファーでチャンバーを洗浄します。ゲイン、取得率、レーザー出力を調整して、ドナーチャンネルとアクセクターチャンネルの両方で単一分子蛍光シグナルを検出します。次に、ドナーを励起し、視野内のドナー分子の80%がフォト退色するまでのタイムトレースを取得します。映画の最後に、640ナノメートルのレーザーをオンにして、分子の一部が光退色するまでアクセプターを直接励起します。視野を変更し、ドナーとアクセプターの励起の手順を繰り返して、条件ごとに3つの動画を収集します。粒子ピッキングの単一分子FRETトレースを選択するには、ドナートレースとアクセクタートレースの合計強度が時間の経過とともに安定しているトレースを選択します。次に、ドナーとアクセプターの強度に反相関の変化があるトレースを選択します。シングルステップの光退色を示すドナー分子とアクセプター分子を選択し、5秒以上の長さをトレースします。FRET欠損を計算します。最後に、原稿に記載されている手順に従って、隠れマルコフモデリング(HMM)によって立体構造状態を特定します。シアニン色素によるAZPの標識は、銅触媒による環化付加反応によって達成され、ドナーおよびアクセプター蛍光色素で標識された細胞表面集団による548UAAの効果的な原形質膜標識をもたらしました。SDS-PAGE電気泳動では、548UAAを発現するHEK 293T細胞で250キロダルトンの単一バンドが観察され、これは全長二量体mGluR2と一致しました。ドナーおよびアクセプターの漂白イベントに対する複数の短命および長期の代表的な選択的痕跡をここに示します。立体配座状態はHMM解析を用いて同定した。離散FRET状態間の遷移を理想適合値から抽出し、遷移密度ヒートマップとしてプロットした。理想化されたFRETトレースは、識別された各確認の滞留時間に関する情報も提供します。ドナーチャネルとアクセプターチャネルを持つ単一分子の痕跡を以下に示します。さらに、単一分子FRETは、mGluR2システインリッチドメインの4つの立体配座状態を明らかにします。単一分子のプルダウンには効率的なピーク保存が不可欠であり、このプロセスには注意が必要です。さらに、酸素消去剤はイメージングの直前に添加する必要があります。この標識法と1分子FRET実験は、複数の受容体に適用され、受容体の活性化と受容体機能の調節のメカニズムに新たな洞察をもたらしました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

生化学

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...